脲酶波氏比色法和全酶法测定UN 医学课件.pptVIP

脲酶波氏比色法和全酶法测定UN 【实验目的】 掌握脲酶波氏比色法及脲酶-谷氨酸脱氢酶法测定尿素原理 熟悉脲酶波氏比色法的操作过程及影响因素 了解自动化分析的酶偶联法测定 一、概述 非蛋白含氮化合物：包括除蛋白质以外的尿素、肌酐、肌酸、尿酸、氨基酸、核苷酸、嘌呤、谷胱甘肽等多种含氮有机物。其中尿素、肌酐、尿酸和肌酐清除率可作为肾小球滤过功能的指标。 1、直接法（（二乙酰一肟法） 利用二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。由于二乙酰不稳定，故由试剂中的二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。 本法试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。在标本数量多时加热开始难以达到100℃，各管间受热温度也可能不一致，因而本法重复性不佳。 【方法概述】 2、尿酶法 是直接或间接测定经脲酶作用后由尿素转变成的氨，氨的测定方法有： 1) 利用电导电极测量导电率的变化。 2) 利用pH电极或pH指示剂测量反应前后pH值的变化。 3) 波氏法。波氏比色法在基层实验室较多用。 4) 偶联谷氨酸脱氢酶340nm测定吸光度下降率。 5）干化学法。 与谷氨酸脱氢酶偶联，使用连续监测法测定，可自动化，目前在多数医院普遍使用。 二、脲酶－波氏比色法 脲酶水解尿素产生2分子氨和1分子二氧化碳，氨在碱性介质中与苯酚及次氯酸钠反应，生成蓝色的吲哚酚阴离子，此过程需用亚硝基铁氰化钠催化反应。蓝色吲哚酚的生成量与尿素含量成正比，在630nm波长比色测定。 尿素+H2O 2NH3 +CO2+2H2O 氨+次氯酸钠+苯酚 吲哚酚（蓝色） 【原理】 脲酶 NaOH 亚硝基铁氰化钠 1.脲酶应用液（R1） 脲酶≥5000U/L， EDTA-Na21.26g/L，磷酸氢二钾5.77g/L。 2.酚显色剂（R2） 苯酚10g，亚硝基铁氰化钠(含2分子水)0.05g，溶于1L无氨去离水中。 3.碱性次氯酸钠溶液（R3） 氢氧化钠5g溶于无氨去离子水中，加“安替福明”8ml (相当于次氯酸钠0.42g)，再加无氨去离子水至1L。 4. 尿素标准液:7.14mmol/L 【试剂】 【操作】 (一)、手工操作： 加入物(ml) 测定管 标准管 空白管 脲酶应用液(R1) 0.5 0.5 0.5 血 清 0.01 — — 尿素标准液 — 0.01 — 无氨去离子水 — — 0.01 混匀，37℃水浴15min 显色剂1(苯酚、亚硝基铁氰化钠） 1.0 1.0 1.0 显色剂2（NaOH、次氯酸钠） 1.0 1.0 1.0 混匀，置37℃水浴20min。波长550nm，空白管调零，读取吸光度。 【计算】 1mmol/L尿素=6.02mg/dl尿素 =2.802mg/dl尿素氮 【参考范围】 1.8-6.8 mmol/L。 【注意事项】 1.呈色稳定性 在1h内吸光度的波动仅为0.005，12h后较最初吸光度读数也仅增高0.01～0.02。 2.本法批内CV＜1.8%，批间CV＜2.7%；回收率96.71%～103.35%；与酶偶联法对照测定病人标本37例，相关系数(r)为0.972；线性范围较宽，达20mmol/L以上。 3.尿素浓度以前习惯用尿素氮mg/dl表示，因为一个尿素分子中有2个氮原子，所以1mmol尿素相当于28mg尿素氮（1mmol/L尿素相当于2.8mg/dl尿素氮）；另外还有以尿素氮mmol/L表示，则1mmol/L尿素=2mmol/L尿素氮。世界卫生组织推荐尿素用mmol/L表示，我国卫生部临检中心也规定一律使用此表示方法，不再用尿素氮一词。 4.大气及试剂用水中的氨可明显干扰尿素的测定，使结果假性增高。酶工作液接触大气8d后，测定值上升1.07mmol/L；去离子水明显吸收氨，使测定值明显升高。 胆红素在34.2μmol/L以上时尿素测定值有不同程度的降低，在25.65～68.4μmol/L之间时，平均降低0.47mmol/L，但与胆红素含量不成正比。 5.本法亦能测定尿液中尿素，但尿中的氨比血清中的氨多1000多倍，因而测定尿氨时，氨必须经过校正，可测定用脲酶处理前尿标本中的氨以校正内源性氨。 【注意事项】 【原理】 尿素+H2O 2NH3 +C