产纤维素酶菌种的筛选与优化.pdfVIP

目 录 实验一 产纤维素酶菌种的分离与初筛 实验二 产纤维素酶菌种的复筛与保藏 实验三 酶活测定与传代保藏 实验四 产纤维素酶菌种的紫外诱变育种 实验五 产纤维素酶菌种的产酶条件优化 实验六 产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析 实验一 产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定 一、实验目的 1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理； 2 ．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。 二、实验原理 自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到 细菌、 放线菌、 真菌， 大到一些食草类昆虫与动物。 这些生物与绿色植物一起构成了这个世 界的碳循环。在发酵堆肥中，存在着大量的， 耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分 解，菌种需要： 1. 内切型葡萄糖苷酶（ endo-1,4- β-D-glucanase,EC3.3.1.4, 简称 EBG ），也称 Cx 酶、 CMC 酶、 EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解 β-1,4-糖苷键， 将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素； 2. 外切型葡萄糖苷酶（ exo-1,4- β-D-glucanase,EC3.2.1.91 ），也称 C1 酶、微晶纤维素酶、 纤维二糖水解酶（ Cellobiohydrolase, 简称 CBH ）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端 水解 β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子； 3. Β-葡萄糖苷酶（ β-glucosidase ，EC3.2.21 ，简称 BG ）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二 糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。随着葡萄糖 聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。 只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。就单菌落而言，霉菌如木霉、曲 霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要 是真菌纤维素酶。 本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基， 只有能够水解纤维 素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长， 利用筛选培养基分离产纤维素 酶的微生物。 以羧甲基纤维素钠（ CMC-Na ）为唯一碳源，通过微生物分解利用 CMC-Na ，分离 出能产纤维素酶的菌种； 刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。 三、实验仪器及试剂 1．材料 土样 取自学校校门口小树林 5— 20cm深处； 2 ．仪器 试管、烧杯、移液管、平板、锥形瓶、玻璃珠、电磁炉、电子称、量筒、培 养皿、酒精灯、移液枪、接种环、高压灭菌锅等； 3 ．培养基 （1）筛选培养基（ 500ml ） 4 4 4 CMC-Na 10g 、(NH )2SO 1.4 g 、MgSO 0.3g 2 4 4 4 KH PO 2g 、MnSO 1.6mg 、 FeSO 5mg ZnSO 4 2.5mg 、CoCl2 2.0mg 琼脂 20g PH7.0 （2 ）保藏培养基（ 500ml ） CMC-Na 15g 、MgSO4 0.5g 、K2HPO4 1.