核酸提取与鉴定.pptxVIP

核酸的提取与鉴定;研究对象：基因组DNA、质粒DNA、 总RNA、mRNA等 ;核酸提取的主要步骤：; 总原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。;第一节 预处理;2、培养细胞 培养细胞需弃细胞培养液，用缓冲液进行多次漂洗，方可用于提取核酸。 ;3、血液 血液可以是新鲜血液或者冻贮血液； 注意抗凝剂的选择，一般用EDTA-Na2或枸橼酸钠，不可使用肝素； 全血离心弃血清（或血浆）、 加适量的红细胞裂解液（破膜液），裂解红细胞，再加适量的细胞核裂液（破核液），裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA 释放出来。; ;1、提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备;所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。 严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。; 在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩，应勤换手套。 ;第二节 DNA的提取 ;1、酚-氯仿提取法 ;2、浓盐法 ;3、玻璃棒缠绕法;4、玻璃颗粒吸附法;二、质粒DNA的提取;质粒DNA的提取有效方法;1、培养细菌和扩增质粒;2、收获细菌和溶菌;3、提取质粒; 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来;（2）氯化铯密度梯度分离法 ;（3）煮沸裂解法;第三节 RNA的提取;常用的RNA酶抑制剂 ;RNA的提取方法 ;2、盐酸胍-有机溶剂法;3、氯化锂-尿素法;4、一步快速热酚抽提法; 二、mRNA的提取;第四节 核酸的鉴定;3、紫外吸收法 DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值，用标准样品测得在波长260nm处，A260＝1时，样品中双链DNA浓度为50 μg/ml，单链DNA或RNA浓度为40 μg/ml。 DNA(μg/μl) = A260×50×稀释倍数/1000 RNA（μg/μl ） = A260×40×稀释倍数 /1000 ;二、核酸纯度检测;三、核酸完整性检测; 基因组DNA抽提结果电泳图 ;总RNA抽提结果电泳图 ;第五节 电泳;电泳的基本原理;一、琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖凝胶的浓???与DNA分离范围;琼脂糖凝胶电泳装置 ;DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。 ;RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，但是无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率才与分子量成正比。;电泳仪;操作流程大致为： 凝胶的制备→胶板的制备→加样→电泳 →观察和拍照。;DNA片段的 琼脂糖电泳;琼脂糖凝胶电泳有许多优点： 操作简单，电泳速度快，分离核酸范围广，样品不需事先处理就可以进行电泳； 电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好； 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。;二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 ;聚丙烯酰胺凝胶形成过程示意图;聚丙烯酰胺凝胶电泳检测核酸，常见两种聚丙烯酰胺凝胶：用于分离纯化双链DNA片段的非变性电泳聚丙烯酰胺凝胶和用于分离和纯化单链DNA片段的变性聚丙烯酰胺凝胶。其转载DNA样品量也比琼脂糖凝胶大，分辨力也高于琼脂糖凝胶电泳，相差1bp的DNA片段也能分开，但其操作复杂。;聚丙烯酰胺凝胶制胶装置; ;1、提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备;所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。 严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。;2、浓盐法 ;3、玻璃棒缠绕法;2、收获细菌和溶菌;3、紫外吸收法 DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值，用标准样品测得在波长260nm处，A260＝1时，样品中双链DNA浓度为50 μg/ml，单链DNA或RNA浓度为40 μg/ml。 DNA(μg/μl) = A260×50×稀释倍数/1000 RNA（μg/μl ）