淋巴细胞标志检测.pptxVIP

细胞免疫学检测（cellular immunoassay）一、淋巴细胞表面标志物检测 (Assay of membran molecules for lymphocytes） 一、免疫细胞分离技术 (Technic of separation for immunocyte)二、免疫细胞表面标志检测技术 （Assay of membran molecules for ～ ）三、免疫细胞功能检测技术 （Assay for Immunocyte Tuntion ）四、细胞因子与黏附分子检测技术（Assay for Cytokine and Adhesion molecule）免疫系统(Immune system)免疫器官(Immune Organs)免疫细胞(Immunocyte)★免疫球蛋白(Immunoglobulin)主要组织相容性复合体 (Major Histocompatibility Complex; MHC)细胞因子(Cytekine)白细胞分化抗原和粘附分子(Leukocyte Differentiation Antigen and Adhesion molecule)免疫细胞(immune cells)指:所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核吞噬细胞、树突状细胞及其他细胞免疫细胞分离技术(Separation of immunocytes)人外周血(peripheral blood )白细胞分离一、原理(principle)： 红细胞/白细胞比例不同（600～1000）：1，密度不同，沉降速度不同。二、方法(method)： 1、自然沉降法（直立静置RT30～60min，紧贴红细胞层上的白膜层） 2、聚合物加速沉降法（加某些高分子物使RBC凝集成串加速沉降，如明胶）人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的分离加入对倍稀释的血液样本 水平式离心20min时结果聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)(1.077±0.001g/L) 分离人外周血淋巴细胞以密度为1.077±0.001/g/LPercoll混悬液(处理过的硅胶颗粒)原液密度(density)为1.135g/L+等量PBS, 高速离心 (centrifugation)由下而上的逐减的连续密度梯度(density gradient)淋巴细胞纯度98%, 单核细胞纯度78%流程长, 步骤繁, 成本高人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯(purificcation)人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞, 但混有单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯：（一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水）（二）血小板的去除（离心、洗涤）（三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬）（四）淋巴细胞亚群的分离★淋巴细胞亚群的分离分离依据： 1、淋巴细胞不同亚群其细胞表面标志（ specific membrane molecule/surface marker） 2、淋巴细胞不同亚群其细胞分化抗原（antigen of cluster differentiation ；CD）分离方法：1、Precipitation of E rosetteErythrocyte Rosette forming cell; ERFC The sueface of T lymphocyte contains the receptor (CD2) of sheep erythrocyte ,which is called E receptor for short . T lympho-cytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor. Lymphocytes + sRBC , centrifugation----- T lympho-cytes(底) / B lympho-cytes（界面） 2、黏着性（理化）： B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而T淋巴细胞则不易附着～（例）尼龙棉柱分离 — 直接流出的是T淋巴细胞。3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原的细胞～（例）1、亲和板结合分离 (affinity ～) 2、免疫磁珠分离 （immunomagnetic beads） 3、流式细胞术分离 (FCM) 磁性微珠(magnetic beads):磁性微珠是以金属离子为核心，外层均匀包裹高分子聚合体的固相颗粒。磁性微珠上既可标记针对某种细胞表面抗原的特异性抗体（直接法）; 也可标记羊抗鼠IgG抗体(间接法），使分离细胞的范围大大扩大正选（positive