探讨作物育种上基因编辑技术的应用与发展前景.docx

? ? ? ? ? 探讨作物育种上基因编辑技术的应用与发展前景 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 关键词： CRISPR/Cas9 分子育种 基因编辑技术 遗传操作 品种培育在农业生产中的地位十分重要，人类自从种植作物以来，就在不断地选育具有经济价值的作物性状，这实际上是在利用作物的自然基因突变。随着改造自然能力的提高，人类又开始利用辐射和化学诱变等手段人为加快突变频率，以便更快更好地获得作物新品种。但无论是天然突变还是诱发突变，突变的产生都是随机的，需要经过艰苦漫长的选育过程才能得到稳定的新品种，一个新品种的育成往往需要十几甚至几十年的不懈努力。分子生物学的发展使得人们可以采用基因工程手段加快作物育种，转基因技术在作物育种中取得了极大成功。然而由于生命活动的复杂性，目前对其中的规律并不完全清楚，所以公众对外源基因的导入是否会引起作物自身产生一些无法预料的变化，从而影响转基因作物的安全性，存在广泛的质疑。由于特异性核酸酶的发现，目前出现的新一代基因工程技术一基因编辑技术可通过对作物自身基因进行精确改变，而不需要外源基因的导入就能培育新品种，因而受到了作物育种家的极大关注，将对农业生产产生巨大的影响。本文介绍基因编辑技术在作物育种上的应用前景及目前面临的挑战。 1、基因编辑技术 基因编辑技术是指对基因组中的某些DNA序列进行定点改造的遗传操作技术，其基本原理是通过人工构建能特异性切割DNA序列的核酸酶，对目的基因片段进行精准的靶向剪切，使DNA双链断裂，随后激发细胞内的DNA修复机制，产生基因修改。常用的核酸酶主要有锌指核酸内切酶、类转录激活因子效应物核酸酶以及成簇规律的间隔短回文重复相关蛋白9核酸酶，其中CRISPIVCas9技术系统以其简单、精确、高效和低成本而得到广泛应用。 1.1 CRISPRCas9系统的作用机制 CRISPRCas系统最初发现于细菌及古细菌中。作为细菌的免疫防御系统，通过靶向结合降解外源DNA，能对外来病毒和噬菌体的侵染产生抵制作用。这些存在于微生物基因组且包含间隔重复序列的位点被命名为成簇规律的间隔短回文重复序列(clusteredreaularlyinterspacedshotpalindromiorepeats，CRISPR)。CRISPIVCas系统通常分为两大类：第I类是有多个Cas蛋白组成的复合体来行使核酸酶功能，第"类是由单个Cas蛋白(如Cas9等)行使核酸酶功能。CRISPIVCas9属于第"类，只需要成熟的ceRNA(CRISPR-deevedRNA)、traceRNA(eans-activatingchimerioRNA，反式激活嵌合RNA)和单个Cas9蛋白(核酸酶)就能实现对外源DNA的切割[11]。人工改造的CRISPRCas9系统主要由引导RNA(singleguideRNA，sgRNA)和Cas9蛋白结构域组成。其中，sgRNA起精确定位作用，其5，端前20个核苷酸序列决定Cas9蛋白特异性切割基因组DNA的部位;工作时，CRISPRCas9系统的sgRNA和Cas9形成嵌合蛋白，切割与sgRNA5，端前20个核苷酸序列互补的DNA双链，产生DNA双链断裂，然后通过同源重组或非同源末端连接修复途径产生基因突变。 1.2 DNA断裂修复机制 基因编辑有两个关键点：一个是对基因的精确剪切，另一个是细胞DNA的自身修复。正常情况下细胞中一旦出现DNA双链断裂，细胞就会启动DNA自我修复途径，同源重组与非同源末端连接是细胞修复DNA双链断裂的两种常见方式。 非同源末端连接是断裂处两端的DNA在一些修复元件的参与下直接修复的通路，是主要的修复机制，通常引起部分碱基的丢失，少数情况下也会有碱基插入，导致的结果是基因敲除。非同源末端连接技术相对简单，没有外来DNA的插入，造成的基因功能丢失类似于天然突变的结果，但它远比天然突变的效率高，也远比化学物理诱变精确，是目前基因编辑技术在农作物育种中的主要作用方式。同源重组是以损伤区域DNA的同源序列作为模板进行的精确修复，可保证基因组的准确性。同源重组可以实现精确的基因替代，其意义远比非同源末端连接重大。但由于其是通过基因替代的方式来实现精确的基因编辑，通常需要引入与断裂处原序列相同的DNA修复模板，使之以同源重组的方式原位插入到染色体中，这就涉及到了外源DNA转入的问题。但与传统转基因不同的是：首先，这个基因是该作物的可杂交品种中已经存在的同源基因，这样的作物品种采用传统杂交技术也能做到，只是后者更费时费力而已;其次，在传统的转基因过程中，外源基因是随机整合到基因组中，而同源重组则是精确地将基因插入到基因组中的预定位置。如果人们能接受杂交育种的话，则没有理由不接受这样的作物，因为传统杂交实际存在将目的