生物物理试验方法.pptxVIP

第3讲 荧光光谱;荧光：某些物质受到照射后发出能量较低的光，一旦光照停止，光线也立即消失，称为荧光。入射光和发射光频率之差称为斯托克频移。 满足上述条件即为荧光。因此荧光范围比较宽，从X射线到红外光谱区仍然是荧光。 其他的能量如（化学反应、加热、生物代谢等）也会有荧光。生活中很多现象都与荧光相关。如：钞票防伪，日光灯管，萤火虫发光。 ;;a)光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态，过程约10-15s。此时，荧光分子处于激发态。 b)内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用，以无辐射跃迁过渡到低的能级。 c)外转换：处于电子激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的作用，以及能量转移，过渡到低的能级 d)荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子激发态最低振动能级的分子将以辐射的方式回到基态，平均寿命约为10ns左右。 e)系间转换：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 如 电子自旋改变，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。 f）振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。; 荧光发光分为内源荧光和外源荧光。 外源荧光应用很广，如染料结合作为荧光探针与蛋白质结合后吸附在大分子上可以提供微区极性、疏水区大小、粘性、分子间距离等。 荧光寿命和量子产率： 荧光猝灭： 荧光能量共振转移： 时间分辨荧光光谱： 荧光各向异性： 荧光量子点标记，转基因荧光标记 双光子荧光光谱;2.常用荧光光谱;;2).荧光光谱的特征;镜像规则的解释;3 .荧光光谱仪及使用 技术;;样品池长度通常为1cm，因此荧光强度为;3）.荧光光谱的环境效应;4. 荧光光谱参数;荧光寿命和量子产率示意图;（ 2). 荧光各向异性;5. 荧光实验方法及其用途; 荧光猝灭泛指任何可以减低样品荧光强度的过程。 狭义主要指那些由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的情况。 原因：溶剂猝灭剂和荧光物质之间发生相互作用而引起荧光效率降低或激发态寿命缩短，导致强度降低。 卤素离子、重金属离子、氧分子都是猝灭剂。 研究主要集中在可测量的“狭义荧光猝灭”。 生化方面主要应用猝灭现象指示分子之间的相互作用。 揭示发色团和猝灭剂的接近程度，反映发色团在蛋白和膜上的局域位置，质子的通透性和膜的通透性 。 碰撞猝灭可以用来确定猝灭及的扩散系数。 采用Stern-Volmer方程来解释;（1）碰撞猝灭分析 Lackowicz “Principle of fluorescent spectroscopy”Chapt 8, p237-p265 碰撞猝灭的Stern-Volmer 方程 F0 / F =1+kqτ0 [Q]＝1＋KD[Q] 其中kq是猝灭速率 τ0 是无猝灭剂存在时的荧光寿命 [Q]是猝灭剂的浓度 F0/F～[Q]曲线。单一线性猝灭曲线预示所有发色团和猝灭剂是具有相同的可接近性。如果其中有一种不可接近，则Stern-Volmer曲线不是线性的。; 荧光发色团和猝灭剂形成不发荧光的复合物，吸收光以后，以无辐射跃迁的形式回到基态。 解离常数为：;2）荧光偏振 （1）荧光偏振现象及用途 一旦用偏振光照射，从许多样品出射的光也是偏振的。当样品各个方向出射的偏振光是不相同的，可以说样品显示出偏振的特性。 研究偏振可以提供分子及周围环境更多的信息： 偏振光照射到荧光分子上，分子对光的吸收和发射过程与分子框架相对偏振光的偏振方向相关。 荧光偏振可以用来测量蛋白质的变形，蛋白质的结合以及蛋白质的内部动力学。 与膜结合的荧光发色团用来估计膜的内部粘性以及居于相变温度之上的磷脂复合物的特性。 ;;（1）能量转移： Fluorescent resonance energy transfer（FRET) 术语：F?rster resonance energy transfer 纪念德国科学家 Theodor F?rster ;激发态的供体能量被受体吸收，荧光强度下降。 能量转移可能以两种方式：辐射和非辐射。共振转移的机制： 偶极子相互作用通过非辐射进行能量转移（10nm)。 荧光能量转移的先决条件： 1)供体和受体有一定谱重叠（共振能量转移）。 2)供体和受体距离比较近（正比于R6)。 3）供体和受体跃迁偶极距的方向不能垂直;F?rster 公式： kT=kD(R0/R)6 , kD=1/ ? D 如果波长采用cm，采用摩尔消光系数则： R0=9780(J(λ)к2n-4ΦD)1/6（单位为0.1nm) J=∫f(λ)ε(λ)λ4dλ（谱重叠积分）;;; 一般情况下，要用水合体积进行计算旋转相关时间。 如果是球形的样