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【连结转变议论专栏】 各位分生研究高手 :你们好 ! 我将目的基因 (1911bp) 与 pcDNA3.1 连结 ,用 T4DNA 连结酶,目的基因与载体的浓度比相等 ,目的基因与载体均采用两步酶切 (Xbal 1 和 EcoR 1 酶 )法,37 度,16h. 因 pcDNA3.1 载 体无蓝白筛选 ,只好盲挑克隆菌株 ,但已经克隆了 7 次 ,均未成功.急请高人指导 !多谢 !多谢 !!!! 我的经验是目的基因的比率一定要大， 应为质粒的 3～ 10 倍， pcDNA3.1 是有抗性的啊，你只能挑菌提质粒酶切鉴定的 1 感觉态是不是有问题 (问题经常在这里 ) 2 你的目的基因是直接 pcr 出来的然后酶切的吗 ?如果是 保护碱基没有 ,如果没加的话 ,酶切效率可能会比较低 . 3 双酶切一般不会自连 ,如果自连长斑的话可能是其中一种  ,加 酶没有完全切开 . 建议 :用一下商品化的  T 载体 ,看看终究哪步出了问题  . 1、首先你要保证载体及目的片段都完全切开。 2、目的片段的量要大，即在紫外灯下很亮。 3、胶、电泳液和染色液都用新配的。 4、温度不要太低，连结时间长一点。 一般来说不会有太大问题。祝好运！ ！ 谢谢指教！ 质粒是 Amp+ 的，在 LB Amp+ 的培养基上长的单克隆菌，我已挑出了很多个（ 60-70 ），但不幸的是无一个是载有目的基因的阳性克隆！你的经验是目的基因比率要粗心些，可否指教一下详细的浓度？谢谢！ 双酶切，没有原因连不上的，看你的情况长了那么多单克隆菌落，应该有。不要急着一遍又一遍的重复做，先静下心剖析一下。 你确定没有阳性克隆吗？质粒的提取是否有问题，质粒的质 量不好，有些限制酶会切不动，先做一下 PCR 看看？ 转个切开的载体看看，是不是也能长那么多菌落？ 多谢各位好意的高手们！ ！ 我的目的基因是 PCR 后立刻进行的酶切，引物设计时加了保护碱基。而且每次酶切后都进行了切胶纯化，目的基因的泳带也很亮，电泳缓冲液等均是新配的，可能最大的问题是目的基因与质粒的浓度比不够，要大出那么多倍，真的是有很大的差距！ 连结的温度要高一些？多少度最适宜？请指教！ 衷心的道一声谢谢！ ！！ 连结的温度：如果是粘端连结 很好啊！如果是平端连结 16  4 度就能够了啊。 我连过几次，度 20 小时。 感觉态菌 Top 10 是新转变的，已经考证一点问题都没有！ 你的 PCR 产物能够先连 T 载体。再酶切，不然你每次都 PCR ，你能够连了 T 载体后测序一下，努力！ 我用的是 T4 连结酶，酶切形成的是拈性末端，真的只要 4 度就能够了吗？ 质粒提取没问题，很纯，亮度也很好，也许是两种酶中的一种没切开，造成了质粒自己环化。谢谢！ 讨教： T 载体能够连结任何目的基因吗？是否也需要进行双酶切后才能进行连结？也用 T4 连结酶吗？谢谢！ 不同的保护碱基有不同的酶切效率， 你能够去查 biolab 的目 录，此外，关于比较大的片段常规方法是先连结到 T-vector 上然后进行双酶切，因为这样比较保险；太小的片段才直接 酶切，因为小片段的酶切回收是很麻烦的。 你的片段这么长， 所以建议你最好将 pCR 产物装进 t 载体中再做酶切， 此外再 测一下序就更保险了。不要担心，我相信肯定能够做出来。 ...ljq: 你好！ 真诚的谢谢你的指教！在分生领域我是新兵，更切实的说在 这条研究路上我刚才抬起脚， 道路充满了荆棘与坎坷！ 苦啊！有了你们的热心帮助，我会少摔一些跤，少走一些弯路。再次表示感谢！ ...ljq: 你好！ 真诚的谢谢你的指教！在分生领域我是新兵，更切实的说在 这条研究路上我刚才抬起脚， 道路充满了荆棘与坎坷！ 苦啊！有了你们的热心帮助，我会少摔一些跤，少走一些弯路。再次表示感谢！ 还有一个问题急待解答： pcDNA3.1 在 16 度中酶切， EcoR1 酶和 Xba 1 酶大概需要几小时才能切开？请有经验的高手在百忙中指点。谢谢！ 可能会切不开，因为有次别人把我的水浴锅关了，我用 EcoR1 酶切了一个晚上也没切开。温度在 20 度左右吧。 1、粘端连结 4 度留宿就能够。我用过好多次。 2、T 载体和 PCR 产物直接连。因为 PCR 产物会在末端加 A ， 和 T 载体能够直接相连（有的 Taq 酶是不加 A 的），不用连结酶的。我用大连宝生物的 T 载体。用法看说明书。很简单 我也碰到这种情况， 有些载体就是切不下来， 原因也不清楚，你能够把 LB Amp+ 的培养基上长的单克隆菌作个 PCR 鉴定，如果没有目的片段，建议换换载体。 60-70 个假阳性克隆，说明载体酶切不全。 要严格按照实验程序，做阳性比较，阴性比较。 感觉态最好每次新作。 多谢各位的无私指教