120301医学分子生物学1.pptxVIP

医学分子生物学;?? 而当你走进实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象。否则，你对事物的观察就会受影响。;研究生的学习;科学研究的成功之路;科学研究;分子生物学(molecular biology);生物大分子(biomacromolecule) ;生物大分子(biomacromolecule) ;遗传因子;《基因论》(1926年);威尔金斯 ;1962年诺贝尔生理学或医学奖得主;1959年诺贝尔生理学或医学奖得主 ;;1965年诺贝尔生理学或医学奖;雅各布Fran?ois Jacob（1920-，法国）;2011年诺贝尔生理学或医学奖 ;分子生物学与医学;分子诊断（molecular diagnosis）;分子诊断-第四代实验室诊断技术;原位杂交技术－筛选21三体（间期）;PCR技术;2）治疗能力-正确治疗方案与手段;腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID);转基因技术;克隆与“动物药厂”; ? 核酸水平（DNA, RNA)------ 核酸的分离纯化 ; PCR技术 ；分子杂交 ；分子克隆 ； RNA干扰；基因芯片；DNA测序等 ； ? 蛋白水平------ 蛋白分离纯化；Western Blot; 蛋白芯片等 ； ? 蛋白质与核酸相互作用 凝胶滞后实验；染色体免疫沉淀；DNAaseI足纹分析；Southwestern杂交； ? 蛋白质与蛋白质相互作用 酵母双杂交；蛋白质免疫共沉淀； ; The Nobel Prize in Physiology or Medicine：;课程主要内容;? 核酸和蛋白质的结构与功能及相互作用是分子水平生命活动的基础； ? 内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根本原因。;核酸（DNA，RNA）和蛋白质是生物体中最重要的生物大分子，是分子生物学研究和分子诊断的对象。 ;核酸的化学组成;碱基;嘧 啶;;磷酸; 磷酸二酯键 ;核苷酸链（一级结构）; DNA的双螺旋结构;核酸变性;; 核酸的变性与复性;第一节 核酸分离纯化的设计及原则 第二节 真核细胞基因组DNA的分离纯化 第三节 质粒DNA的提取与纯化 第四节 真核细胞RNA的分离纯化 ;核酸的一般理化性质 ;第一节 核酸分离纯化的设计及原则;材料与方法的选择;核酸分离纯化的原则： 一 保持核酸一级结构的完整性,因完整的一级结构是 核酸结构和功能研究的最基本的??求； 二 是尽量排除其他分子的污染，保证核酸样品纯度。;保持核酸的完整性（一） ;保持核酸的完整性（二）;技术路线的设计; 非核酸的大分子污染物 －－主要是蛋白质、多糖及脂类物质； 非需要的核酸分子 －－分离某一特定的核酸分子时，其它的核酸分子皆为杂质； 影响后继研究的溶液和试剂 －－加入的有机溶剂和某些金属离子； ; 核酸的浓缩、沉淀与洗涤;核酸的沉淀与洗涤;核酸的鉴定与保存;1. 浓度测定 荧光光度法：核酸的荧光染料如溴化乙锭（ethidium bromide－EB），Sybr green I等嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。; 琼脂糖凝胶电泳 －－－分离、鉴定和提纯核酸片段 凝胶中核酸的迁移率： ① 核酸分子的大小：线性双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。 ② 琼脂糖浓度：利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的核酸片段（0.3％-60Kb;2%-100bp) ③ DNA构型：相同分子量的闭环（Ⅰ型），开环（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA，以不同速率通过凝胶。迁移率Ⅰ型Ⅲ型Ⅱ型。 ;质粒DNA三种构型;不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围; ⒉ 纯度鉴定 紫外分光光度法：主要通过A260与A280的比值来判定有无污染。在缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。 荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低。;纯净DNA OD260 / OD280 应=1.8；纯净RNA OD260 / OD280应=2.0； OD230主要吸收为多肽，苯酚等，纯净的核酸样品OD260 / OD230 应=2.0； OD320检测溶液的悬浊度和其它干扰因子，样品纯净，OD320应接近零，=0.01时应进行校正。 ; ⒊完整性鉴定 琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrop