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第三章 酶的提取与分离纯化 第三章 酶的提取与分离纯化 第三章 酶的提取与分离纯化 ◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。 ◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。 1.细胞破碎 细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。 表1细胞破碎方法及其原理 1.1 机械破碎法 通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。 常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。 机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。 1.2物理破碎法 通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。 常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下： (1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。 (2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。 (3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（ cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。 1.3化学破碎法 通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。 常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。 有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。 表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。 1.4酶促破碎法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。 将细胞在一定的pH值和温度条件下保温一段时间，利用细胞本身酶系的作用，使细胞破坏，而使细胞内物质释出的方法，称为自溶法。 自溶法效果的好坏取决于温度、pH值、离子强度等自溶条件的选择与控制。 为了防止其他微生物在自溶细胞液中生长，必要时可以添加少量的甲苯、氯仿、叠氮钠等防腐剂。 根据细胞外层结构的特点，还可以外加适当的酶作用于细胞，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中，使细胞破裂。 2.酶的提取 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 2.1酶提取的主要方法 表2 酶的主要提取方法 2.2影响酶提取的主要因素 主要影响因素是酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度。 此外，还受到温度、pH值、提取液体积等提取条件的影响。 (1)温度：提取时的温度对酶的提取效果有明显影响。一般说来，适当提高温度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的扩散速度。 (2)pH值：溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著影响。为了提高酶的溶解度，提取时pH值应该避开酶的等电点。 (3)提取液的体积：增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对进一步的分离纯化不利。所以提取液的总量一般为原料体积的3～5倍，最好分几次提取。 此外，在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小，则扩散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒表面，从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速率；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出来，直至达到平衡。 在提取过程中，为了提高酶的稳定性，免致在引起酶的变性失活，可适当加入某些保护剂。如酶作用的底物、辅酶、某些抗氧化剂等。 3.沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 沉淀分离是酶的分离纯化过程中经常采用的方法。 沉淀分离的方法主要有盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等。 表3 沉淀分离方法 3.1盐析沉淀法 盐析沉淀法简称盐析法，是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶