实验讲稿综述-1.pptxVIP

麦冬多糖对大鼠急性心肌损伤和人脐静脉内皮细胞过氧化的影响 目 录 中药麦冬是百合科多年生草本植物沿阶草属植物麦冬的干燥块根，味甘、微苦、性微寒。 增加机体耐缺氧能力 抗心律失常 能降血糖，并能促进使胰岛细胞的恢复 提高机体免疫功能 心血管疾病是危害人类健康最普遍、最严重的疾病，患病率为各疾病之首，病死率仅位于恶性肿瘤之后。越来越多的研究证明，多糖能治疗多种疾病，且无明显毒副作用。 研究方面 研究内容 研究目标 细胞水平 动物水平 （1）生物体外：探讨麦冬多糖对人脐静脉内皮细胞的抗氧化作用 （2）生物体内：了解麦冬多糖对急性心肌缺血大鼠的抗损伤作用 细胞水平 动物水平 血管内皮细胞是细胞与血液物质交换的一层屏障, 具有分泌功能, 可通过血液流动、凝血以及运输大分子和炎症细胞介导局部组织的平衡，因此血液有害物质损伤机体时，常常先受累, 所以在对心脑血管内皮细胞的研究中被常常用来作为模型载体。H2O2可诱导细胞的氧化损伤，其氧化反应可以参与内皮细胞病理变化的各个环节，在血管性疾病的病理过程中起非常重要的作用。 注射大剂量ISO诱导大鼠心肌损害模型，在心电图、心肌代谢及组织病理学变化等方面均与人类自然发生的急性心肌梗塞非常相似。ISO诱导的大鼠心肌缺血模型是评价心肌保护药物的常用模型之一。 H2O2诱导的氧化损伤人脐静脉内皮细胞（HUVEC） ISO诱导的急性心肌缺血大鼠 实验目的 本实验分别以ISO 诱导的急性心肌损伤大鼠和H2O2诱导的氧化损伤人脐静脉内皮细胞作为研究对象，以麦冬多糖作为研究目标，对麦冬多糖进行生物体外(in vitro)和生物体内(in vivo)的药理作用研究，有助于更完整地认识麦冬多糖对急性心肌缺血性损伤的作用。 MTT法检测HUVEC细胞增殖 取HUVEC细胞，用0.25 %的胰蛋白酶消化 轻轻吹打制成细胞悬液 接种到96孔板中，每孔100 µL 更换无血清的1640培养液加入麦冬多糖 37 ℃、5 % CO2 培养箱中培养4 h 每孔加入100 μL DMSO 混匀 用酶标仪于570 nm 处测吸光度OD 值 计算并分析细胞生长抑制率 试剂盒法 SOD与MDA含量检测 流式细胞仪检测细胞内ROS Annexin V-FITC细胞凋亡检测 细胞内NO含量检测 2.动物标本的采集及处理 水合氯醛麻醉 Medlab监测心电图 眶静脉取血 摘取心脏标本 计算心指数 1.心肌缺血大鼠模型的建立 3.心肌酶谱四项测定 由***检验中心全自动生化分析仪雅培C8000检测 5.心肌病理形态学观察 6.心肌超微结构观察 包埋 切片 染色 封固 观察 漂洗 包埋 染色 切片 固定 染色 切片 观察 固化 4.ELISA法测定血清NO、ET-1及IMA的含量 7.荧光定量PCR测心肌组织eNOS、ET-1基因表达 1.提取RNA 2.RT反应 3.荧光定量PCR 4.分析 MTT法检测麦冬多糖对HUVEC细胞增殖的影响 图 1 不同浓度麦冬多糖对 H2O2损伤的人脐静脉内皮细胞的影响 与正常组OD值相比，模型组OD值显著降低，说明H2O2对HUVEC的抑制作用明显，对细胞有明显的氧化损伤作用。各浓度的麦冬多糖均能保护H2O2对HUVEC的氧化损伤作用，0μg/mL，25 μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL浓度麦冬多糖抑制率分别为55.95±7.20，54.35±6.64，48.20±8.07，44.22±7.31，42.58±3.10，抑制率均有下降，说明麦冬多糖对双氧水氧化损伤的HUVEC细胞有保护作用。 细胞内一氧化氮含量测定 图 2 OJP1 对细胞NO浓度的影响 与正常对照组相比，H2O2损伤模型组NO的含量显著降低。与模型组相比，不同浓度的麦冬多糖干预后细胞上清中NO的含量均显著提高（P0.05或P0.01）。从图可见，随着麦冬多糖浓度的降低，NO的含量逐渐升高，与增值作用的结果一致。 表 1 细胞内SOD活力和MDA含量的变化 组别 Group 超氧化物歧化酶 (U/μg) SOD (U/μg) 丙二醛(μmol/g) MDA(μmol/g) NC 37.99±2.17 1.19±0.14 MC 12.53±0.69## 1.78±0.08## OJP1-25 62.55±3.30** 1.73±0.21 OJP1-50 20.901.70** 1.69±0.19 OJP1-100 31.54±1.30** 1.24±0.11** OJP1-200 28.88±1.75** 1.63±0.16 与正常对照组相比，HUVEC细胞经250 μmol/L的H2O2损伤后，细胞内SOD活性显