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细菌的革兰氏染色法 细菌的革兰氏染色法 实验二 细菌的革兰氏染色法 学习细菌的革兰氏染色原理和方法。 单染色法：只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。 复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。 革兰氏染色机制：由于G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质，增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。而G＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（24h培养物）、革兰氏染色液一套 3. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。 4. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 5. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15-20秒，后立即用流水冲洗。 6. 复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。 7. 镜检：观察染色结果并绘图。 记录所观察到的两种菌革兰氏染色颜色的差别，并绘图。 如图所示，被染为紫色的部分即为金黄色葡萄球菌，红色部分即为大肠杆菌。 六、问题与讨论 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？哪一步是关键？Why? 按照操作顺序来看 1、首先，必须强调的是实验过程中全程的无菌操作：玻片的消毒、接种环的杀菌以及实验所用材料试管的无菌使用； 2、其次，是金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌的刮取过程中，它们的量一定要适中，以免过多影响后期观察结果； 3、再者，涂片操作结束后，通过酒精灯的烘烤将细菌固定，要注意控制烘干的程度，防止细菌全被烧死； 4、接下来的染色过程中，注意各染色剂染色的时间长度，尤其是95%乙醇脱色的时长，18秒为适宜时长； 5、最后，就是吸干水分，注意油镜的使用，先在低倍镜下找视野，再转成高倍镜、油镜。 关键步骤：我认为是95%乙醇脱色的这一步。因为如果脱色过度，会使革兰氏阳性菌呈假阴性，以致观察时整个视野都是红色；如果脱色不够，会使革兰氏阴性菌呈假阳性，以致观察时整个视野都是紫色，影响观察结果，干扰实验。 这次实验让我真真正正感受到了做实验的乐趣。每一个操作步骤都必须精准地完成，少有偏差，就会对实验结果产生很大影响，就比如我第一次试验就是脱色时间较长，用了20秒，以致油镜观察时，视野全是红色；第二次试验则是脱色时间较短，只能依稀看到一点被染成 红色的大肠杆菌；第三次则吸取教训，把握每一步，最后看到了紫红相间的视野。期待下一次实验课。