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药物化学实验1 药物化学实验1 《药物分析》实验大纲 ----氯霉素滴眼液的高效液相色谱分析法 1. 理解内标法和外标法测定组分含量的原理与方法； 2. 掌握高效液相色谱仪的结构及正确使用方法。 2.1 基础理论来源 《药物分析》（人民卫生出版社，主编 刘文英，第6版），第四章 药物定量分析与分析方法验证（课本p96-97）。 2.1 实验原理 内标法和外标法是高效液相色谱（HPLC ）中常用的两种含量测定方法。 内标物可以消除仪器与操作或制备样本时带来的误差，精密称取样品后，加入一定量的内标物，然后制成适当溶液进样分析。根据样品和内标物的重量及其相应的峰面积，求出某组分的含量。 外标法是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定外标物（标准对照品），把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物（标准对照品）与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。本法俗称外标一点法，色谱定量的原理是峰面积与样品浓度成正比，实验条件要求：需要已知浓度的标准样品，且待测成分与杂质间分离良好。 （一）实验条件 色谱仪 Agilent 1260高效液相色谱仪 色谱柱 C18柱 (填料：SinoChrom ODS-BP 5 μm ，尺寸：4.6 mm×250 mm， 大连依利特分析仪器有限公司) 流动相 甲醇:水 (v:v = 80:20) 流 速 0.8 mL/min 检测波长 272 nm （二）标准贮备液的制备 1. 1㎎/mL氯霉素标准贮备液的配制 精密称取氯霉素100 mg至100 mL容量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度。 2. 1 mg/mL对硝基苯酚(内标) 标准贮备液的配制 精密称取对硝基苯酚约100 mg置l00 mL量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度。 (三) 内标法测定氯霉素的含量 1. 相对校正因子的测定 精密吸取对硝基苯酚标准贮备液1.0 mL，置l0 mL容量瓶中，精密加入氯霉素标准贮备液1.0 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀。色谱仪基线平稳后，进样20 μL 得色谱图。读取对硝基苯酚及氯霉素峰面积或峰高，按公式计算相对校正因子（本实验中，采用峰面积法）: W i W i h A f i 内标＝i （或 f i 内标＝i ） W 内标W 内标 A 内标h 内标 式中：W i ――氯霉素重量 W 内标――对硝基苯酚的重量 A i （h i ）――氯霉素的峰面积（峰高） A 内标（h 内标）――对硝基苯酚的峰面积（峰高） 2. 样品含量测定 精密吸取滴眼液0.4 mL (约相当于氯霉素1 mg，标示量为2.5 mg/mL)，置10 mL容量瓶中，并加入对硝基苯酚的贮备液1.0 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μL ，得色谱图。按下式计算标示量的百分含量（标示量，简单来说就是主药含量，它的百分含量=实际量/标准量，百分标示量是指的实验测得值与百分之百的偏离程度，即在一个允许范围内稍大或者稍小）： W i A i W 内标标示量%=?100%=??f ?100% W 样品A 内标W 样品i 内标 式中：W i ――氯霉素重量 W 内标――对硝基苯酚的重量 W 样品――滴眼液中氯霉素的标示重量 (四) 外标法测定氯霉素的含量（外标一点法） 精密称取氯霉素25.0 mg置10 mL容量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度，浓度为2.5 mg/mL。精密吸取该溶液1.0 mL置l0 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μL，得色谱图，读取峰面积。 精密吸取滴眼液（标示浓度2.5 mg/mL）1.0 mL置l0 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μL ，得色谱图，读取峰面积。按峰面积与样品浓度成正比计算滴眼液中氯霉素含量，即： A 样品C 样品 A 对照C 对照 式中：A 样品：样品的峰面积； A 对照：对照品的峰面积； C 样品：样品的浓度（mg/mL）； C 对照：对照品的浓度（mg/mL）； 1. 内标法和外标法定量的原理、方法及特点。 2. 怎样选择流动相？流动相中水的作用? 3. 内标物应具备哪些条件？ (1) 由于操作不当，系统中混入了气泡，则对测定有何影响? 如何排除这些气泡? (2) 变换流动相溶剂时，