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诺如病毒实验室检测 诺如病毒实验室检测 诺如病毒实验室检测 诺瓦克病毒（Norwalk Viruses ，NV ）是人类杯状病毒科(Human Calicivirus ，HuCV) 中诺如病毒（Norovirus,NV ）属的原型代表株。NV 是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒（Norovirus,NV ）。诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-like Virus ，SLV ），正式名称为札如病毒(Sapovirus,SV)，合称为人类杯状病毒。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。 诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。诺如病毒有许多共同特征：直径约为26～35nm ，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA ；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g/cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV 是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。 诺如病毒根据遗传性分为5个基因组，至少有29个基因群，其中基因组I （GGI ）有8个基因群，基因组II （GGII ）有17个基因群，基因组III （GGIII ）有2个基因群，基因组IV （GGIV ）和基因组V （GGV ）各有1个基因群。与人类有关的主要是GGI 、GGII 和GGIV 。 一、标本采集注意事项： 粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h) ，此时为稀、软便，病毒排出量最多。一次流行，至少采集10例患者粪便，每份标本量约1～5ml ，成形便和肛拭子诊断意义很小。标本置4℃可存放2～3周，运送也要低温条件。病人呕吐物是粪便标本的最佳补充，有助于病原的诊断。该标本的采集、储存和运送条件同于粪便。从流行病学角度出发，在水、食物或其它外环境标本中检出NV 意义重要。需注意检测技术要锁定在高度怀疑的传播媒介上，尽早采样并置4℃存放，若是饮用水，需用大容量(5～100L) 浓集病毒后检测。 二、实验室检测： 1、电镜检查：电镜法分直接电镜法(EM)和免疫电镜法(IEM)，EM 法观察的灵敏度较低，要求每毫升粪便样品中至少有大约 106个病毒粒子，因此只能用于患病早期病毒大量排出时采集的样本检测。IEM 法比 EM 法的敏感性可提高 100 倍，主要应用患者恢复期血清捕捉同型抗原，从而增加检出率。电镜法的缺陷在于设备昂贵，不能广泛普及；检测结果与操作者的技能和经验有直接关系；灵敏度相对较低；不适于大规模流行病学调查。 2、免疫法：免疫法包括放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy) 和酶联免疫法(ELISA)。RIA 法的灵敏度比IEM 法可提高10～100倍，可以检测出抗体升高的水平，为流行病学提供更有参考价值的资料。RIA 法的不足之处在于它需要 6 d，且需要放射性同位素标记。为了简化方法，美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法，其灵敏度与 RIA 法相当，该方法已成为美国疾病预防控制中心检测NLV 抗原和抗体的标准实验方法之一。1992年Jiang 等重组杆状病毒表达NV 衣壳蛋白成功后，建立起的 NV 酶联免疫检测方法快速、灵敏、经济，其不足之处是免疫反应的株型特异性太强，所以应用范围还比较窄。酶链免疫法特异性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济，是可广泛应用的检测方法。 3、分子生物学检测：分子生物学检测方法杂交技术和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)除了能更准确、灵敏地检测标本中的NV ，尤其是低浓度的NV 感染外，最大的优点在于可以进一步对病毒进行基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研究具有重要意义。等温核酸扩增法 (NASBA)直接扩增RNA 来检测 NV，样品中病原RNA 得到指数级扩增，产物通过琼脂糖凝胶电泳或斑点印迹杂交鉴定结果。该方法的灵敏度略低于 RT-PCR 法；整个过程只有一步RNA 扩增，避免了RT-PCR 存在的RNA 交叉污染；缩短了操作时间；假阳性率低。RT-PCR 检测食物中NV 存在样品病毒量含量低，样品量大且成分