核酸的物理化学性质.docxVIP

核酸的物理化学性质 核酸的物理化学性质 7-3 核酸的物理化学性质 上册P502 （一） 核酸的水解： 所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。 （1） 酸水解： 糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。 （2） 碱水解： ‘磷酸酯键易水解，RNA 比DNA 易水解，因为RNA 核糖上有2-OH ，水解过 程见P502。 （3） 酶水解： 为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。 1. 核酸酶的分类： 按底物专一性分为RNase （核糖核酸酶）和DNase （脱氧核糖核酸酶）。 按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用点在末端）。 2. RNase ：如牛胰核糖核酸酶（EC 2.7.7.16），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（Py ） ‘-3-磷酸与其他核苷酸之间的连键。 3. 限制性内切酶：为DNase 。 剪裁DNA 的工具，可用于核酸测序和基因工程。 在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。限制性内切酶往往与甲基化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可识别和降解外源DNA 。 断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定位点两条链切断后形成粘末端或平末端。 限制性内切酶命名：如E. coR Ⅰ，第1个字母E(大写) ，为大肠杆菌(E.coli)属名的第一个字母，第2、3两个字母co （小写）为种名头两个字母，第4个字母 R ，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。 （二） 核酸的酸碱性质： 核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。 由于DNA 酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。 （三） 核酸的紫外吸收： 嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在260nm 附近（蛋白质最大吸收值280nm ）。 （1） 可用于测样品纯度（测吸光度A ）： A260/A280比值，纯DNA 应大于1.8，纯RNA 应达到2.0，若样品混有杂 蛋白，比值明显降低。 对于纯样品，从260nm 的A 值即可算出含量。A 值为1，相当于50μg/mL DNA 双螺旋，或40μg/mL单链DNA （或RNA ），或20μg/mL寡核苷酸。 （2） 核酸的摩尔磷吸光系数ε（P ）：为含有1克原子磷（30.98g ）的核酸在260nm 处的吸光系数。 ε（P ）= A / CL. = 30.98 A / W L A ：吸收值， C ：每升溶液的磷摩尔数，C=W/30.98， L ：比色杯内径。 一般天然DNA ε（P ）为6600，RNA 为7700~7800 由于双螺旋结构使碱基对的π电子云发生重叠，使紫外吸收比单链减少， 由此可判断DNA 是否变性。 DNA 变性时ε（P ）值升高，增色效应。 DNA 复性时ε（P ）值降低，减色效应。 核酸比所含核苷酸单体的ε（P ）低40~45%。 （四） 核酸的变性、复性及杂交： （1） 变性：核酸双螺旋区的氢键断裂变成单链，不涉及共价键的断裂。 ‘‘降解：多核苷酸骨架上共价键（3，5-磷酸二酯键）断裂，分子量降低。 引起变性因素：热变性，酸碱变性，变性剂（如尿素，甲醛等）变性（竞争形成氢键）。 DNA 变性温度：又称熔点或熔解温度，为DNA 双螺旋结构失去一半时的 温度，用T m 表示，DNA 的T m 一般为82~950C 。DNA 变性是爆发式的，变性在一个很窄温度范围内发生。 P508 图14-4为DNA 变性过程。 影响T m 的因素： 1. DNA 的均一性：均一则T m 窄，如poly (A-T) ， poly d(G-C) 等， T m 窄。 2. G -C 含量：T m 值与G -C 含量成正比，G -C 含量越高，T m 值越高，因为 G -C 间三个氢键。 G -C 含量与T m 关系的经验公式： G -C% = (Tm - 69.3) ×2.44 可由G -C 含量计算T m 或由T m 计算G -C 含量。 3. 介质离子强度： 离子强度较高时，DNA 的T m 值较高，DNA 较稳定，因此DNA 的保存在 含盐（如1mol NaCl）缓冲溶液中。 RNA 的