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基因工程涉及的主要技术遗传专业姓名：张红学号1310170039导师：张斌基因工程 基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。基因工程的操作流程分子杂交及DNA测序限制酶的切割与连接3、将目的基因导入受体细胞2、基因表达载体的构建4、目的基因的检测与鉴定1、目的基因的获取DNA和RNA的提取和纯化PCR扩增构建基因文库，从基因文库中“钓”取农杆菌转化法等基因工程主要技术1DNA和RNA的提取和纯化2凝胶电泳3基因扩增技术-PCR反应4分子杂交5DNA序列测序一、DNA和RNA的提取和纯化 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。一般程序 1、供体的核酸分离 供体细胞培养 收集(菌体)细胞 细胞破碎 分离总DNA 分离细胞器 分离总RNA 分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异性RNA 染色体DNA(组建基因组文库) cDNA（组建cDNA文库） （1）基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它 （2） 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法DNA提取的几种方法基因组DNA-CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 CTAB法流程图酒精沉淀植物材料裂解液液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解质粒DNA－碱裂解法 碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年发表，基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。 在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。 当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。 通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 对数期菌体上清液沉淀溶液I充分重悬抽提干燥溶解溶液II裂解酒精沉淀质粒DNA溶液溶液III中和离心洗涤碱裂解法流程图 蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 盐离子的去除： 70％的乙醇洗涤总RNA的提取 根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法： 1）热苯酚抽提法 2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法 其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。二、凝胶电泳常见的凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳的原理： 分离原理-在电场的作用下，DNA分子在琼脂糖凝胶中移动时，有电荷效应和分子筛效应。 检测原理-溴化乙锭（EB）在紫外光照射下能发射荧光，当用EB对DNA样品染色时，加入的EB就插入DNA分子中，荧光强度与DNA含量成正比。 琼脂糖凝胶电泳分辨大小在0.1-60kb间的DNA片段；而要分辨较小分子质量的DNA 片段，要用聚丙烯酰胺凝胶，它的分辨率在0.001-1kb之间。聚丙酰胺凝胶电泳三、基因扩增