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甲胎蛋白异质体检测及应用 甲胎蛋白异质体检测及应用 甲胎蛋白异质体检测及应用 (淄博市第一医院检验科, 淄博255200) 甲胎蛋白(AFP)是一种糖蛋白, 在哺乳动物胚胎期由肝脏实质细胞和卵黄囊细胞合成, 来源于内胚层的胃肠道粘膜细胞也可少量合成。在正常情况下,AFP 主要存在于胎儿循环中, 随着胎儿发育成熟,AFP 合成逐渐减少。出生时脐血中AFP 浓度可达10～100mg/L , 出生后一年降至正常成人水平。但若新生儿AFP 明显升高提示新生儿肝炎, 先天性胆道闭锁或有能分泌AFP 的胚胎性恶性肿瘤。早在上世纪中期, 就有学者发现肝细胞癌患者血清AFP 淀粉凝胶电泳时常出现不同的迁移率, 而新生儿, 胎儿的AFP 电泳迁移率相同。当时认为是AFP 所含的唾液酸含量不同所致, 并提出AFP 异质体的概念。 AFP 异质体形成的确切机制还不十分清楚, 其过程可能 是这样的:增生的肝细胞及肝癌细胞于G 1期和S 期合成 AFP 并将其分布于核周, 内质网腔及高尔基体分泌小囊中, 位于粗面内质网及高尔基体中的AFP 在糖基化转移酶参与下受到不同的糖基化修饰后分泌到循环中。由于糖基化的不同, 导致了AFP 异质性的差异。另一可能的原因是糖基化转移酶异常造成糖基化后AFP 构象的改变。 AFP 的糖链结构能与多种凝集素相作用, 与不同凝集素 结合的AFP 分子结构蛋白部分基本相同, 但糖链部分有所不同。不同的糖链决定其与凝集素的亲和力。根据亲和力的不同, 可将AFP 异质体分为不同类型, 如豌豆凝集素(LCA) 亲和型、豌豆凝集素不亲和型, 刀豆凝集素(C on -A) 亲和型、刀豆凝集素(C on -A ) 不亲和型。另外有一种分类方法是将电泳获得的区带从阳极开始以1、2、3编号, 结合凝集素进行命名。 AFP 异质体许多糖链的结构尚未完全明了, 与豌豆凝集 素(LCA ) 相结合的基础是AFP 糖链岩藻基化(LEA 与岩藻糖有较强的亲和力) , 由于胚胎期AFP 几乎无岩藻糖成分。因而可以认为这种分子糖链的异常是糖基化异常的反映,AFP -L3与LC A 的结合位点是门冬酰胺连接的岩藻糖化的N - 乙酰葡萄糖胺。 1　AFP 异质体的检测方法 1.1　亲和层析法　首先制备亲和层析柱, 方法是先将植物 凝集素与琼脂糖等载体交联, 然后装柱。测定时将待检样品过柱, 此时交联的凝集素会与糖链特异性结合, 再用缓冲液洗脱, 收集洗脱液测定其含量, 即可得到A F P 异质体的含量。该方法的优点为重复性好、层析柱可反复使用。缺点是速度 缓慢, 不适合批量样品测定。 1.2　双向凝胶电泳法　可用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶, 先 将凝集素与凝胶混和成凝胶板, 样品电泳时由于凝集素与糖链的亲和作用使糖蛋白泳动速度减慢。而后将疑胶旋转90度, 加入抗体后再行电泳, 此即所谓亲和免疫交叉电泳怯. 本院于上世纪八、九十年代应用该方法只定性检测病人血清中的AFP 的含量。 1. 3　亲和印迹法　与双向电泳法基本相似, 先进行电泳, 电 泳毕将蛋白转印到硝酸纤维膜或尼龙膜上, 再用酶标抗体或核素标记抗体等标记物显色进行测定。目前已有商品化的试剂盒供应。 1.4　酶标法　该方法类似于双抗体夹心法, 先将抗体包被 酶标板, 加入待测样品,37度反应, 洗涤后加入过氧化物酶标记的凝集素, 最后加入底物显色。 1.5　直接固相时间分辨荧光免疫测定　可用竞争法或双抗 体夹心法进行测定, 一般使用单克隆抗体采用镧系元素标记, 时间分辨测定荧光强度。 1.6　等电聚焦电泳　先将患者血清进行等电聚焦电泳, 然 后将蛋白转印到硝酸纤维膜上再用酶标记的抗AFP 抗体反应, 最后扫描定量。值的注意:该方法适用于血清浓度在 600ug/L以下的样品, 若AFP 浓度超出此范围, 则需用PH 4. 5-5. 4的缓冲液将样品AFP 浓度稀释至50-500ug/L 之间再 1.7　自动免疫测定　采用硫酸化酪氨酸修饰的AFP 抗体进 行测定, 可用于临床AFP 和AFP 异质体的检测, 主要对AFP -L3和L1进行定量测定, 据称对以下的小肝癌辅助诊断价 值较好。该方法的基本原理可分为四步:(1) 样品中的AFP -L3与试剂1中的豌豆凝集素及5X 硫酸基酪氨酸修饰的抗AFP 单克隆抗体结合, 而AFP -L1因不含岩藻糖链, 故不和 豌豆凝集素LCA 结合。(2) 试剂2中的8X 硫酸酪氨酸修饰的抗AFP 抗