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细胞计数实验 2021/4/19 1.清洗：PBS清洗培养皿或培养瓶上的细胞，除去杂质和死细胞x3次 2.消化：用胰蛋白酶T 消化，在倒置显微镜下观察消化情况，把握消化时机，吸弃胰酶，然后用培养液吹打下消化的细胞（实在不行就完全彻底消化，离心收集）。3.收集：把吹下细胞转入15ml 离心管，用移液器充分混合细胞。4.（稀释：）若浓度太高，不好计数可稀释，可从离心管取100ul 细胞液x10倍稀释至1ml 于EP 管中充分混匀。若细胞浓度差不多的话也可不稀释。 5.加样：先擦洗，晾干计数板，将盖玻片放在计数板正确位置上，后用移液抢吸出10ul 从盖玻片边缘的中央滴加，直至充满整个计数板和盖玻片的空隙。 6.计数：先低倍镜找到计数室，寻找到计数板大方网位置，转到高倍镜，使细胞和计数室的线条清晰，用按表计数7.细胞数计算公式及原理 e（个/ml）=N/V=（四个计数室的细胞总数）/(四个板的总体积)x稀释倍数 =n/(4x1x1x0.1x10)x 稀释倍数=(n/4)x10x 稀释倍数 计数板原理：计数室的边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，盖上盖片后计数室的容积为0.1mm3。根据在显微镜下观察到的细胞数目，换算成单位体积中细胞的数量。 8.种板和清洗：按实验需求进行稀释所需要的浓度种板，一般是5x10个/ml。用酒精棉球清洗计数细胞板 注意事项：细胞液一定要充分混匀，加液时不能有气泡，若细胞团按一个细胞算。 细胞在计数室线上，记上不计下，记左不记右。 蛋白制样和浓度测定 2021/4/24 ①清洗：吸弃培养液，用PBS 清洗培养板上细胞（除去死细胞和杂质） ②裂解：吸弃PBS，准备冰盒和裂解液，整个裂解过程细胞板放在冰面上，用移液枪把配置好的裂解液PIRA 和蛋白抑制剂PMPF 混合液往细胞板孔边缘加入（VPIPA ：VPMPF =100:1一般情况V PIPA =80ulV PMPF =1ul可用ep 管盛），5min后用100ul 枪头嘴折弯做成刮棒迅速刮培养板孔上细胞，再倾斜放入-20℃冰箱5min ，使细胞蛋白完全释放出来。转入EP 管放在-80℃3d 。③收集：把盛有蛋白样的EP 管从冰箱拿出插入冰盒每隔10minx12次在震动机震动后，低温超速离心4℃12000g /min取上清液200ul 于EP 管（一般有好几个样） ④BCA 测样浓度：⑴配置BCA 工作液。按V A ：VB =50:1配实验所需量200ulx 酶标 ? ? 量 ⑶测吸光值：用酶标仪（mby2021）A562保存excel，用散点图及拟合曲线，然后校样算出各组样浓度 ⑤配置buffer 染色稀释：5xbuffer +12%β硫基乙醇（因很粘稠要多配需量）。按V 样:Vbuffer =4:1加入蛋白样EP 管组，一般V 样=200ulV buffre =50ul⑥煮沸：用封口膜封住EP 管，放入沸水浴中30min 。 ⑦上样：各组蛋白量是一定的。如40ug 1号----40/3.385=11.8x1.25=15ul2号----40/2.587=15.56x1.25=20ul3号----40/4.242=9.4x1.25=12ul