第10章基因分析的基本策略.pptxVIP

从上世纪70年代以来，与DNA、RNA操作相关的各种分子生物学技术不断发展，到目前已经形成了一个庞大而复杂的技术体系。基因操作已成为医学研究的重要手段。简单地说，基因操作就是所有涉及到DNA、RNA操作的技术。 本章主要讨论如何对基因进行定性、定量分析；在随后的2章里分别介绍基因功能研究的技术和基因工程的有关内容。;1、需要进行基因的DNA序列分析:序列测定 2、基因的染色体上定位：原位杂交技术 3、研究基因在基因组中的拷贝数：Southern Blot 4、研究基因表达水平：Northern Blot、逆转录实时PCR技术 5、研究基因表达产物的水平：Western Blot、流式细胞仪（ FACS ）;第一节 利用DNA定性、定量分析可从不同角度对基因和基因组进行研究;1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（Dr．Ray Wu） 独创性地设计出一种崭新的引物一延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个COS末端的完整序列； 1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定DNA序列的末端中止法； K.Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法； M.Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。;Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。 2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核糖的3ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷酸链的延伸终止。 如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP，则多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短不一的核苷酸链。 在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将分别终止于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸链进行高分辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。 ;反应：同时加入引物和模板、DNA聚合酶I、一种ddNTP、以及 四种dNTP（有一种带放射性标记）。 变性胶电泳分离反应混合物。 放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性。 结果判读，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。 ;The DNA sequencing method developed by Sanger.;;基本步骤： 1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素（32P、35S）； 2、???将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、不完全的化学修饰； 3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断开DNA链； 4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开； 5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况，直接读出DNA序列。 ;;5`-GATCACTACTG-3`;DNA自动测序仪;;1、揭示基因和基因组一级结构变化在医学研究中具有重要意义。 2、通过DNA序列分析，可以鉴定基因和基因组变异。 3、通过DNA序列分析，可以鉴定分析人工重组的基因。 4、通过DNA序列测定对定点突变进行确认。 ;分析基因拷贝数变化;Southern blot步骤;（4） Southern 转膜：将凝胶中的DNA进行碱变性并将pH恢复中性后，即可将凝胶中DNA转移到固定支持物上。 固定支持物：硝酸纤维素（NC）膜、尼龙膜、化学活化膜和滤纸等。 转移方法：毛吸管虹吸印迹法、电转印迹法、真空转移法。 （5）已知序列的DNA探针的制备 ;（6） Southern杂交：在将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能够结合DNA的膜同样可以和探针DNA结合，在进行杂交实验前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。 （7）杂交结果的检测：采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交时，在杂交洗膜后，将滤膜和X线片装入暗盒，感光后，经冲洗，在X线片上可见黑色条带。;提取DNA;1、对某种生物体基因组拷贝数研究，需要完整提 取出基因组，并需要适当的限制性内切酶酶切； 2、通常要研究的基因序列是已知的。 3、探针序列的选择和探针信号的选择。;二、采用PCR技术也可以分析基因拷贝数; PCR技术对扩增的模板浓度虽然很低，扩增产量以一个恒定的指数率上升，但经过25至30个循环，产量会达到一个平台期，同时PCR过程中，还会出现“试管效应”，因些对不同样本量的比较无法直接用PCR技术来鉴定。 近年来，随着PCR技术的不断改进，如差异显示PCR和实时PCR的发明，可以用于基因拷贝数的分析。;根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12