本科生《P》5第五章目的基因制备与克隆策略310.pptx

《Princple and Technology of Genetic Engineering》《基因工程原理》Professor, Dr. Degang Zhao (Guizhou Key Laboratory of Agricultural Bioengineering, College of Life Sciences, Guizhou University E-mail: mailto:dgzhao@gzu.edu.cndgzhao@gzu.edu.cn 第五章 基因工程工具酶 The Tool of the Gene Engineering 教学目的与要求：1）掌握II型限制性核酸内切酶的切割原理，和部分常用识别位点。2）掌握常作DNA聚合酶的特性和用途。3）了解DNA连接酶和修饰酶在基因操作中的用途。第一节 目的基因的制备 目的基因（Target Gene）：指基因工程中需要进行制备、克隆或利用的基因。制备目的基因要根据需要获得DNA片段，可能是启动子、终止子、内含子，或者是编码某种蛋白完整的序列。目的基因制备方法有直接分离法、基因文库筛选法、PCR扩增法以及化学合成法等。一、目的基因的直接分离法1．限制性核酸内切酶酶切分离法这是最简单的获取目的基因的方法，主要是从质粒、病毒等比较简单的DNA分子或基因组中分离目的基因。无论是已知序列或是尚未测序的序列都可进行分离，只要确定目的基因两侧的酶切位点，就可用相应的酶进行切割，获得目的基因。 2.基因分离的物理化学法其原理是根据基因的DNA分子两条链GC含量差异较大，理化性质、包括浮力密度和解链温度明显不同所采用相应的方法进行分离。（1）密度梯度离心法 将DNA切割成适当片段，富含GC的双链DNA片段浮力密度大，利用密度梯度超速离心技术，可将DNA片段按不同密度大小分开。（2）单链酶解法 基因GC含量高（三个氢键），Tm值高，热稳定性高，可通过控制解链温度使富含A=T区变性解链， GC区维持双链状态，再利用单链核酸酶S1酶切单链部分，获得富含GC的基因片段。（3）分子杂交法 利用DNA单链易与互补链形成双链的原理，将已知基因DNA与目的生物的DNA进行复性，再用单链核酸酶S1酶切除单链，留下的双链即为目的基因序列3.双抗体免疫法分离编码蛋白基因 基因翻译过程中，核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体。利用多肽链制备的抗体及二抗，与多聚核糖核蛋白体一起温育，目的基因的多聚核糖核蛋白体将通过抗原抗体反应与相应抗体形成复合物，利用不连续蔗糖梯度离心将此复合物分离出来，再通过酚/仿抽提法出去蛋白质部分，过oligo-dT柱层析，即可分离出特定蛋白编码的mRNA，反转录即可得到cDNA。目前，可用金黄色葡萄球菌中分离的protein A代替二抗，再用protein A-Sepharose 4B 作亲和层析，分离出特定的多聚核糖体（代替密度梯度离心）。 4．利用酶促反转录直接从特定mRNA分离基因 此法是在目的基因的mRNA占细胞中总mRNA量很大时采用，直接用逆转录酶合成cDNA，与载体重组后导入受体菌扩增，获得目的基因的cDNA克隆。如哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白mRNA占总mRNA的90%以上，用此法克隆了该基因。5．构建基因文库分离目的基因 基因文库分基因组文库和cDNA文库。基因文库可用质粒载体、?噬菌体载体、柯斯质粒（cosmid）载体和酵母人工染色体（YAC）载体进行构建。从基因组文库可以分离获得基因编码序列、调控序列、启动子、终止子、核糖体识别mRNA序列、ARS、端粒序列、间隔序列等，可用于基因结构分析、基因表达和调控研究等。 cDNA文库来自于模板mRNA的核苷酸序列，只能反映基因表达的转录及加工后mRNA产物所携带的信息，所以从cDNA文库可以分离到基因的编码序列。筛选基因文库的方法：① 已知基因序列，可以人工合成核酸探针，通过核酸杂交，从基因文库中筛选出含目的基因的克隆。② 已分离纯化某蛋白，并知其氨基酸序列，根据氨基酸序列合成寡聚核苷酸序列作为探针，筛选基因文库。③ 已纯化某蛋白，未能测出其氨基酸序列，可以该蛋白制备抗体，从cDNA表达文库中筛选出含该蛋白编码基因的克隆。④ 对编码产物未知的基因，采用特殊分离方法如差别显示技术、差减杂交法、遗传互补法等。遗传互补法（功能互补法）原理：当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性状的遗传基因。必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。营养缺陷型受体细胞+外源DNA → 转化细胞涂布在合成培养基上 → 原养型细胞生长受体细胞（无某种表型）+ 外源DNA → 转化细胞涂布在特殊培养基上 → 具有新性状细胞虽然有些