离心实验方案.docVIP

离心实验报告（方案）（分离并鉴定叶绿体和线粒体、细胞核） 一、实验仪器 剪刀、研钵、三角瓶、小烧杯、纱布、超声波细胞破碎仪、玻棒、离心管、注射器、离心管架、普通高速离心机、超速离心机、载玻片、盖玻片、胶头滴管、接种环、镊子、擦镜纸、吸水纸、冰箱、数码显微镜 二、实验药品 液氮、50mmol/LTirs-盐酸缓冲液（PH=7.4）、0.25mol/L蔗糖溶液、詹纳斯绿染液（线粒体）、姬姆萨染液（细胞核）、香柏油（人工）、二甲苯 三、实验材料 蒌蒿鲜茎叶、根 四、实验原理 将破碎后的细胞进行离心实验，设置不同转速梯度，从而得到不同转速下的沉淀，收集沉淀用数码显微镜进行观察，看是否分离得到线粒体和叶绿体。 五、溶液配制 1、缓冲液的配制： 50mmol/LTirs-盐酸缓冲液配法（PH=7.4）：50ml0.1mol/LTris溶液溶于42ml0.1mol/L的盐酸，混匀加水稀释至100ml 0.1mol/LTris：12.114g溶于1L水，0.1mol/L盐酸：1ml36%HCL定容与100ml水中 2、0.25mol/L蔗糖溶液（悬浮介质）： 8.56g溶于100ml水中 注：蔗糖等一些小分子溶液，可以预先在分离的样品中形成密度梯度，在上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。然后0.25mol/L的蔗糖形成的密度梯度的最大值比叶绿体匀浆介质密度要小，满足密度梯度离心的要求 低温下研磨一般都是保护作用，防止蛋白质变性 3、1%詹纳斯绿染液： 称取50mg(pH7.4)，詹纳斯绿B溶于5ml生理盐水中，稍微加热使之溶解后，过滤，即为1%原液 4姬姆萨染液(Giemsa)： 称取姬姆萨粉0.5g，甘油33 ml 、纯甲醇33ml。先在姬姆萨粉中添加少量甘油，然后在研钵内研磨至无颗粒状，再将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2h使其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。使用时吸出少量，用1/5mol/L磷酸缓冲液作10~20倍稀释。 六、实验步骤： 1、样品采集：采集菊科蒿属植物蒌蒿鲜样（茎、叶），用自来水和去离子水反复冲洗干净，淋干水分，剪成碎片至于研钵内加液氮研成精细粉末，称取5g（0.5g）粉末溶于200ml（20ml）缓冲液混匀测ph=7.15（量多需等比例扩大） 2、细胞破碎：将混合液分装入100ml三角瓶中，用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎。机器参数设置如下：6号变幅杆（10-100ml），超声时间3s，间隙时间3s，总时20min，温度21℃，功率45%。 5、超、高速离心实验： （1）、将破碎溶液进行过滤（用两层纱布），上层残渣即为细胞壁部分（收集入冰箱保存待测），滤液为原生质体部分（包括各种细胞器和细胞液等），待离心。 （2）将滤液分装入离心管，先用高速离心机进行初步离心实验，依据现有资料设置离心力和转速，参数如下： 离心力（转数） 所得沉淀 600g（2400转） 细胞核部分 2000g（4000转） 叶绿体部分 10000g（9800转） 20000g（13900转） 线粒体部分（分级得到的线粒体可采用蔗糖密度梯度离心方法来纯化） （3）根据浓度梯度、根茎叶、嫩中老三个指标来进行实验（浓度单位：mg/L，mg/kg） 离心前不同浓度、不同部位、不同时期镉的含量 镉 处 理 浓 度离心前镉含量 0 5 10 20 40 80 160 嫩根 嫩茎 嫩叶 中根 中茎 中叶 老根 老茎 老叶 离心后不同浓度、不同部位、不同时期镉的含量 镉 处 理 浓 度离心后镉含量 0 5 10 20 40 80 160 嫩根 嫩茎 嫩叶 中根 中茎 中叶 老根 老茎 老叶 细分的话： 1、不同浓度、嫩苗期、根茎叶部位、不同转速下镉的含量 不同浓度， 600g嫩根离心镉含量（细胞核部分） 600g嫩根 5 10 20 40 80 160 不同浓度， 10000g嫩根离心镉含量（线粒体部分） 10000g嫩根 5 10 20 40 80 160 不同浓度， 600g嫩茎离心镉含量（细胞核部分） 600g嫩茎 5 10 20 40 80 160 不同浓度，2000g嫩茎离心镉含量（叶绿体部分） 2000g嫩茎 5 10 20 40 80 160 不同浓度， 10000g嫩茎离心镉含量（线粒体部分） 10000g嫩茎 5 10 20 40 80 160 不同浓度， 600g嫩叶离心镉含量（细胞核部分） 600g嫩茎 5 10 20 40 80