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(完整word版)甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法) (完整word版)甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法) PAGE / NUMPAGES (完整word版)甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法) 甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法） 第一部分 基因组 DNA 的提取。 这一步没有悬念，完好能够购置供细胞或组织使用的 DNA 提取试剂盒，假如实验室条件成熟，自己配试剂提取完好能够。 DNA 比较稳固，只需在操作中不要使用暴力，提出的基因组 DNA 应当是完好的。 此步要点在于 DNA 的纯度，即减少或防止 RNA 、蛋白的污染很重要。 所以在提取过程中需使用蛋白酶 K 及 RNA 酶以去除二者。使用二者的细节： 1：蛋白酶 K 能够使用灭菌双蒸水配制成 20mg/ml； 2：RNA 酶一定要配制成不含 DNA 酶的 RNA 酶，即在购置市售 RNA 酶后进行再办理，配制成 10mg/ml。不然可能的结果是不单没有 RNA ，连 DNA 也被消化了。二者均于 -20 度保留。 考证提取 DNA 的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算 OD 比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我偏向于第二种方法，这类方法完好能够明确所提基因组 DNA 的纯度，并依据 Marker 的上样量预计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组 DNA 如不特别指出，所用双蒸水（ DDW ）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约 2ugDNA 于 1.5mlEP 管中使用 DDW 稀释至 50ul； 2：加 5.5ul 新鲜配制的 3M NaOH； 3： 42℃水浴 30min； 水浴时期配制： 4：10mM 对苯二酚（氢醌），加 30ul 至上述水浴后混淆液中；（溶液变为淡黄色） 5： 3.6M 亚硫酸氢钠（ Sigma，S9000），配制方法： 1.88g 亚硫酸氢钠使用 DDW 稀释，并以 3M NaOH 滴定溶液至，最后体积为 5ml。这么大浓度的亚硫 酸氢钠很难溶，但加入 NaOH 后会慢慢溶解，需要有耐心。PH 必定要正确为。 加 520ul 至上述水浴后溶液中。 6：EP 管外裹以铝箔纸，避光，柔和颠倒混匀溶液。 7：加 200 ul 白腊油，防备水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴 16h。 一般此步在 4pm 开始做，娴熟的话不到 5pm 即可达成，水浴 16h 正好至第二天 8am 此后收，时间上很适合。 这一步细节： 1：基因组 DNA 的量不需十分精准，宁多勿少，因为在此后纯化回收步骤中会 有丢掉，且此方法修饰最多可至 4ug。 2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精准。 3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，必定用碱将 PH 调制，不然 PH 不适合会影响 后续纯化汲取。 4：水浴最好达 16 小时，虽能够短至 8 小时，但后者修饰会有不完好。 第三部分 修饰后 DNA 纯化回收 EP 管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。 将移液器枪头伸入白腊油层下，先轻轻加压使此中一小段白腊油排出，而后汲取混淆液至一干净 1.5mlEP 管中。 2：以下使用 Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（ Promega，A7280） 1）70℃水浴预热 DDW ；配制 80%异丙醇； 2）加 1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，柔和颠倒混匀，使 DNA 充足 与树脂联合； 3）因为该试剂盒中仅装备针筒没有针栓，假如有真空负压吸引器，使用起来很 方便；假如没有，需要自备 3ml-5ml 注射器。将注射器针筒与试剂盒供给的回收 小柱密切连结后，将上述混淆物用移液器移至针筒内，用 2ml 以上的 EP 管搁置 小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树 脂堆积。 4）将注射器与小柱分别后拔出针栓，再将针筒与小柱连结，向针筒内加入 2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为清洗步骤。 5）将注射器与小柱分别，将小柱置于干净 1.5ml 干净 EP 管上，离心 12000rpm， 2min，以甩去剩余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后 DNA 处于与树脂结 合状态。 6）将小柱取下置于另一干净 1.5mlEP 管上，移液器加 50ul 预热好的 DDW ，室 温搁置 5min。 7）离心 12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时 EP 管内液体即为洗脱的修饰后 DNA 溶液，终体积为 50ul。 3：加 5.5ul 新鲜配制的 3M NaOH ，室温搁置 15min。 4：加 33ul 10M 乙酸铵，以中和 NaOH，使溶液 PH 于 7.0 左右。 5：加 4ul