第十一章原生质体培养和体细胞杂交.ppt

第十一章原生质体培养和体细胞杂交 PEG法示意图 - + - 桥梁 + - PEG被洗掉 + - + - 电荷重排 + - + - + - + - 膜接触 最为常用。 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞 d PEG结合高钙-高pH诱导法 第二节 原生质体融合 1 概念 2 细胞融合的方法 3 细胞融合的程序 4 应用   原生质体融合示意图 6.1 培养基 ⑴ 培养基成分：KM－P；N6。 ⑵ 渗透压稳定剂：葡萄糖最好。随胞壁再生和细胞持续分裂，其浓度须不断降低，有利生长。 ⑶ 无机盐：降铁、增钙、降铵利于原生质体培养。大量元素含量稍低，钙离子浓度较高，采用有机氮源而少用铵盐。 6 原生质体培养 ⑷ 有机成分：KM－P培养基中含丰富有机物质。 ⑸ 激素：必需生长素和细胞分裂素， 注意其配比；调整激素要考虑后效应。 不同的植物对激素的种类和浓度要求不同。 常采用1～2 mg/L 2,4-D或配以0.2～0.5 mg/L的玉米素。 ⑹ 添加天然有机物如椰汁、酵母提取物等。 5.3 原生质体培养 6.2 原生质体的培养方法 常用液体浅层培养法和悬滴培养法。 1）液体浅层培养法是将原生质体悬浮液2～3 mL于三角瓶或培养皿中，每天摇动2～3次，防止原生质体沉底。 优点：操作简便，对原生质体伤害小； 缺点：不易定位观察原生质体，而且分布不均匀，易造成局部原生质体密度过高或粘聚，影响再生细胞的分裂和进一步生长发育。 （1）液体培养法： 2) 悬滴培养法：用滴管以0.1ml小滴接种到培养皿上，由于表面张力，小滴以半球形保持在培养皿表面。底皿加保湿液，将皿盖盖于底皿上，封口培养。 优点：材料少，生长快，不易污染，易加入培养基，有利于低密度培养； 缺点：原生质体分布不均匀，集中在小滴中央，且与空气接触面大，液体容易蒸发，使培养基浓度提高。 （2） 固液双层培养法 培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。 优点：固体培养基中的营养物质缓慢释放 （3）固体培养法 原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼脂或琼脂糖（37?C左右）等体积混合成0.7% ，培养于培养皿中。 优点：便于定位观察、追踪单个原生质体再生细胞的发育进程，避免细胞间有害代谢产物的影响。 缺点：操作要求严格，混合的温度掌握必须合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快，原生质体不容易混合均匀。 （4） 念珠培养法/琼脂糖珠培养法 含有原生质体的琼脂糖培养基切成块，放在液体培养基中振荡培养。 6.3 培养条件 湿度：密封 温度： 25℃ 密度：104-106/ml。 PH值：一般为5.6-5.8。 新鲜培养基的添加 6.4 原生质体的发育和植株再生 细胞壁再生 分裂 愈伤组织或胚状体形成 植株再生 1) 细胞壁再生 原生质体失去特有的球形外观，这种变化被视为再生新壁的象征. 一般原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天便可形成完整的细胞壁. 2) 细胞分裂与生长 原生质体培养2-7天后,开始第一次分裂, 第一次分裂的时间随植物种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。 原生质体的分裂 3) 愈伤组织形成与分化 2周后 形成多细胞的细胞团，3周后形成肉眼可见的小细胞克隆，大约6周后形成直径为2mm的小愈伤组织。 原生质体培养7-10天后及时添加新鲜培养基，否则形成的细胞团不继续生长。 待小愈伤组织长至1mm时及时转移到固体培养基上进一步生长。 肉眼可见细胞团 愈伤组织 器官发生途径 胚胎发生途径 植株 4) 植株再生途径 植株再生途径 器官形成途径：一步成苗, 将原生质体再生的愈伤组织直接转移到分化培养基上。 胚胎发生途径：两步法，先将愈伤组织培养在含细胞分裂素（0.5～2.0 mg/L）和低浓度2,4-D(0.02～0.2 mg/L)的分化培养基上，让其增殖和调整状态，形成质地较硬的胚性愈伤组织或胚状体，再将其转到含细胞分裂素的分化培养基上再生植株。 7a: 分离原生质体10天后第1次分裂 7b,c:2和3周龄小细胞团 7d,e: 4和6周龄小愈伤组织 7f: 转到 B5h 培养基前8周龄小愈伤组织 8a: 转到 B5H 培养基上的小愈伤组织和体细胞胚诱导 8b: 转到 Boi2y 培养基上的球形胚 8c: 转到MS培养基上的子叶期胚以转化为小植株 紫花苜蓿叶片原生质体分裂、克隆体的发育及通过体细胞胚再生小植株 第二节 原生质体融合 1 概念 2 细胞融合的方法 3 细胞融合的