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基因克隆的基本理论及实验技术第1页/共63页第一课基因克隆的基本概念及理论知识第2页/共63页基因克隆的定义：1. 工具书上：　插入有同一个基因或DNA片段的重组质粒的一个群体，这个群体是由一个重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个基因或DNA片段的克隆。2. 学术文献上：基因克隆是指在体外对DNA按照即定目的和方案进行人工重组,将重组DNA进行扩增以获得目的基因的大量拷贝。它是将DNA或基因组的DNA片段嵌入克隆载体，再将载体植入培养的宿主细胞。科学家将这一过程称为基因克隆：基因表达需有调节的DNA片断控制，要使克隆到的基因能表达、发挥作用，必须将其与调节单位连接起来。第3页/共63页什么是基因？1、基因是存在于细胞内有自体繁殖能力的遗传单位。 2、基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。 3、编码一个RNA或一条多肽链的DNA片段称为一个基因。4、基因是生物体遗传的基本单位，存在于细胞的染色体上，作直线排列。5、基因通过指导蛋白质的合成来传递遗传信息，从而控制生物的性状。第4页/共63页染色体、DNA 与基因之间的关系初级转录本（hnRNA）转录起始点 外显子 内含子 转录终止点 第5页/共63页转录翻译加工加帽 加poly（A）转录起始调控区 转录终止信号 成熟mRNA基因（DNA）蛋白质5’ 非翻译区3’ 非翻译区 基因的结构及其表达蛋白的过程RT-PCR双链cDNA5’第6页/共63页3’3’5’RT-PCR扩增基因的编码区序列mRNA 5’AAAAAAAAAAAAAAAAA 3’3’ TTTTTTTTTTTT 5’RT反应单链cDNA 3’TTTTTTTTTTTT 5’PCR扩增第7页/共63页转录起始调控区（启动子区）的扩增转录起始点 外显子 内含子 转录终止点 转录起始调控区 转录终止信号 基因（DNA）PCR扩增5’3’启动子区序列3’5’第8页/共63页基因的编码区及启动子区序列必须通过连接到质粒上构建成重组表达载体，然后进行目的片段扩增及功能研究。第9页/共63页什么是质粒（Plasmid）？ 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。第10页/共63页质粒的重要特征（1） 是染色质外的环形双链DNA分子；（2）能自主复制，是能独立复制的复制子； （3）质粒对宿主生存并不是必需的； （4）质粒上常带有耐抗生素基因； （5）质粒DNA上有多个酶切位点。第11页/共63页第12页/共63页限制性核酸内切酶/view/15646.htm限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）:是从细菌中分离出来的一种识别并切割特异的双链/view/758.htmDNA序列的内切核酸酶。目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷酸顺序。AAGCTTTTCGAAGAATTCCTTGGAEcoR IHind IIIGCTTGGATTCGA AATTC A AGCTT A第13页/共63页限制性核酸内切酶的命名法则限制性核酸内切酶的命名：一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如：EcoR I是从大肠杆菌Escherichia coli RY13 中第一个发现的内切酶I 。EEscherichia(属)cocoli(种)RRY13(品系)I首先发现在此类细菌中发现的顺序OHPO4第14页/共63页DNA连接酶 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的，最初是在大肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助/view/37286.htmATP或/view/522866.htmNAD水解提供的能量催化DNA链的5’-PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键将两条紧邻DNA链连接起来。 GCTTGGCTGGAC ATT TAA AATTC A连接酶连接酶CTGATTGACTAAGAAT