第十七节血红蛋白的提取和分离(二).pdfVIP

血红蛋白的提取和分离（二） 主讲：黄冈中学优秀生物教师 王小敏 回顾上节课： 二、实验操作 阅读血液组成成分，思考： 1、血液由 血浆 和血细胞 两部分组成。 2、血细胞中 红细胞 细胞数量最多， 红细胞的含量最高的有机化合物是 血红蛋白 。 3、该化合物是由 2 条 α- 肽链 和 2 条 β- 肽链 构成的，其中每个亚基中都含有一 2 2 个能与 O和 CO结合的 亚铁血红素 基团。 （一）样品处理 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。 思考 1：你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为 什么？ 哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。 1、红细胞的洗涤： ①洗涤目的：是去除杂蛋白。以利于后续血红蛋白的分离纯化。 ②洗涤方法： 思考 2 ：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢 搅拌？ 防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。 2、血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积，再加 40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌 10 分钟。 思考 3：加入的蒸馏水、甲苯的作用分别是什么？充分搅拌的目的是什么？ 蒸馏水的作用：使红细胞大量吸水胀裂。 甲苯的作用：溶解红细胞的细胞膜。 充分搅拌的目的：加速红细胞的破裂。 3、分离血红蛋白溶液： （二）粗分离——透析 1、过程：将血红蛋白溶液装入透析袋，置于磷酸缓冲液（ pH为 7.0 ）中，透析 12 小时。 在透析过程中， 血红蛋白不能通过半透膜， 而离子和小分子能够通过半透膜 扩散进入磷酸缓冲液中。 2、透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。 （三）纯化——凝胶色谱操作 1、凝胶色谱柱的制作： ①取长 40 厘米，内径 1.6 厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作： 橡皮塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网， 再 用 100 目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。 注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面， 否则难 以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 ③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 ④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。 2、凝胶色谱柱的装填 装填材料：交联葡聚糖凝胶（ G-75）、20mmol/L 磷酸缓冲液 “G”：表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。 75：表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水 7.5 克。 步骤 操作要求 ① 固定色谱柱 色谱柱垂直固定在支架上 ② 计算称量凝胶 根据色谱柱体积计算凝胶用量 凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 ③ 配制悬浮液 或：凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴 ④ 装填悬浮液 一次性缓慢倒入；轻轻敲打 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡 ⑤ 缓冲液洗涤平衡 12h 注意事项： ①凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 ②装填凝胶柱时不得有气泡存在。 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次