2021年质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定实验报告.docVIP

2021年质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定实验报告 2021年质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定实验报告 PAGE / NUMPAGES 2021年质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定实验报告 质粒DNA提取、 定量、 酶切与PCR判定 一、 试验目 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA方法; 2.学习并掌握了解质粒酶切判定方法; 3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度原理和方法; 4.学习并掌握PCR基因扩增试验原理和操作方法; 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳原理和使用方法。 二、 试验原理 1.PCR(多聚酶链式反应) 在DNA聚合酶催化下, 能够DNA为模板, 以特定引物为延伸起点, 以dNTP为原料, 经过变性、 退火、 延伸等步骤, 在体外（缓冲液中）复制DNA, 使目DNA按2n方法呈指数形式扩增。 PCR一次循环具体反应步骤为: A.变性: 加热反应系统至95℃, 使模板DNA在高温下完全变性, 双链解链 。 B.退火: 逐步降低溶液温度, 使合成引物在低温（35－70℃,通常低于模板Tm值5℃左右）, 与模板DNA互补退火形成部分双链。 C.延伸: 溶液反应温度升至中温72℃, 在 Taq酶作用下, 以dNTP为原料, 引物为复制起点, 模板DNA一条单链在解链和退火以后延伸为一条双链。 2.质粒DNA提取与制备 (1).碱裂解法: 染色体DNA与质粒DNA变性与复性存在差异: A.高碱性条件下, 染色体DNA和质粒DNA均变性; B.当以高盐缓冲液调整其pH值至中性时, 变性质粒DNA复性并保留在溶液中, 染色体DNA不能复性而形成缠连网状结构, 可经过离心形成沉沉淀去除。 (2).离心层析柱: A.硅基质膜在高盐、 低pH值状态下可选择性地结合溶液中质粒DNA, 而不吸附溶液中蛋白质和多糖等物质; B.经过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成份去除; C.低盐, 高pH值洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 质粒DNA定量分析（紫外分光光度法）: A.物质在光照射下会产生对光吸收效应, 且其对光吸收是含有选择性; B.多种不一样物质都含有其各自吸收光谱: DNA分对波长260nm紫外光有特异吸收峰 蛋白质对波长280nm紫外光有特异吸收峰 碳水化合物对230nm紫外光有特异吸收峰 C.A260/A280及A260/A230比值能够反应DNA纯度; A260/A280=1.8 DNA纯净 A260/A2801.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质 A260/A2801.8 含RNA杂质, 用RNA酶去除。 质粒DNA酶切判定: 限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用基础工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列特殊DNA序列结合, 或是与其周围特异位点结合, 并在结合位点切割双链DNA。 琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖是一个天然聚合长链状分子, 能够形成含有刚性滤孔, 凝胶孔径大小决定于琼脂糖浓度。 DNA分子在碱性环境中带负电荷, 在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时, 有电荷效应与分子筛效应: 不一样DNA, 分子量大小及构型不一样, 电泳时泳动率就不一样, 从而分出不一样区带(迁移速度与分子量对数值成反比关系). 三、 材料与方法: （一）试验材料: 1.PCR 仪器: PCR仪、 台式离心机、 微量加样枪、 灭菌薄壁离心管 材料: 菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目片段-绿色荧光蛋白GFP)】、 无菌去离子水、 2×Premix Taq、 引物 2. 质粒DNA提取与制备 仪器: 恒温培养箱、 台式离心机、 离心层析柱、 Eppendorf管、 微量加样枪、 离心管 材料: 溶液 P1（S1）、 溶液P2 (S2）、 溶液P3（S3）、 去蛋白液PE（W1）漂洗液WB（W2）、 洗脱液EB（Eluent)、 含pMD19-T质粒大肠杆菌DH5α 3. 质粒DNA定量（紫外分光光度法） 仪器: 比色杯、 紫外分光光度计、 微量加样枪 材料: 蒸馏水、 质粒ＤＮＡ 4.质粒DNA酶切判定 仪器: 1.5mlEP管、 微量加样枪 材料: 无菌水、 10×M酶切缓冲液Buf R、 质粒DNA、 Hind III (15U/ul)、 EcoR I(12U/ul) 5.琼脂糖凝胶电泳 仪器: 凝胶电泳系统、 凝胶成像系统 材料: 电泳指示剂、 Gelview、 TBE、 琼脂糖、 DNA Marker 5000、 电泳缓冲液 （二）试验方法 准备目DNA: 菌液煮沸10min 准备目DNA: 菌液煮沸10min, 冷冻, 室温解冻后离心取上清