γδtreg诱导免疫耐受性树突状细胞在移植物抗宿主病中的作用及机制研究.pdfVIP

γ δ Treg诱导免疫耐受性树突状细胞在移植物抗宿主病中的作 用及机制研究 背景:异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是治疗恶性血液系统疾病的有效 手段,急性移植物抗宿主病(aGVHD)成为阻碍移植成功的关键因素之一。目前 aGVHD的最主要预防和治疗手段为免疫抑制药物,但容易导致移植后感染风险增 加;体内外去除T细胞是另一种常用的策略,但也伴随着植入失败、移植后复发率 增高等风险。 近年来越来越多的免疫细胞亚群被发现在aGVHD调控中起重要作用,过继免 疫细胞输注调控aGVHD具有较好的临床应用前景。调节性γ δ T细胞(γ δ Treg) 是新发现的γ δ T细胞亚群,该细胞亚群具有与Foxp3+α β Treg细胞相似的生物 学特性,发挥负向免疫调控功能。 我们前期建立了高效的γ δ Treg体外诱导扩增富集体系,并发现该群细胞 能负向调控小鼠allo-HSCT后aGVHD但不影响GVL效应,但机制尚未完全明确。 通过细胞间接触的方式抑制T细胞的增殖活化是其中的机制之一。 进一步阐明γ δ Treg负向调控aGVHD的完整机制将为其临床应用奠定基础。 抗原提呈细胞树突状细胞(DC)在aGVHD发生发展的病理生理过程中起重要作用。 DC在预处理后活化,活化后的DC处理并递呈宿主抗原给供者来源的T细胞, 并进一步通过共刺激分子信号使得T细胞活化和增殖,这是aGVHD起始阶段的关 键事件。近年来通过诱导免疫耐受性DC的生成是aGVHD治疗中重要的研究方向。 α β Treg与免疫耐受性DC之间有互相诱导生成的作用,两者共同参与维持 移植后的免疫耐受。因此,我们推测γ δ Treg诱导免疫耐受性DC 的生成是其发 挥负向调控aGVHD的机制之一。 在本研究的前两部分,我们首先在体外研究了γ δ Treg诱导免疫耐受性DC 的生成,包括对DC成熟、吞噬、刺激活化T细胞、黏附、迁移等功能影响,并探 讨了可能的机制;进一步在人源化小鼠aGVHD模型体内环境中验证了 γ δ Treg 诱导免疫耐受性DC是其发挥负向调控aGVHD作用的机制之一。另一方面,目前关 于Foxp3+γ δ Treg 的研究都是采用富集了 γ δ Treg 的γ δ T混合细胞,但这不 能完整反映Foxp3+γ δ Treg 的真实生物学功能。 目前尚未发现Foxp3+γ δ Treg与Foxp3-γ δ T之间具有差异表达的膜蛋白 可供分选纯化,这也大大限制了对Foxp3+γ δ Treg 的生物学功能的进一步研究 和相应的临床应用。因此,本研究的第三部分通过单细胞转录组测序技术探索了 Foxp3+γ δ Treg与Foxp3-γ δ T的转录组差异,为寻找两者之间差异表达的膜蛋 白从而进一步能纯化分离Foxp3+γ δ Treg提供新的思路。 具体研究内容分为3部分:1)γ δ Treg细胞体外诱导免疫耐受性DC生成的 作用及机制研究;2)γ δ Treg细胞体内诱导免疫耐受性DC 的生成发挥负向免疫 调控aGVHD的作用;3)γ δ Treg细胞表面特异性分子标记的筛选和纯化。第一章 γ δ Treg细胞体外诱导免疫耐受性DC生成的作用及机制研究目的:研究γ δ Treg体外诱导免疫耐受性DC生成的作用,包括对DC成熟、吞噬、迁移、黏附、 活化T细胞等功能的负向免疫调控作用,并阐明相应的机制。 方法:从健康成年人外周血中分离单个核细胞(PBMCs),分别进行DC和yδ Treg 的诱导培养。γ δ Treg与iDC或mDC共培养48h后磁珠分选去除γ δ Treg, 通过流式细胞术检测共刺激分子荧光强度,采用FITC-Dextran 的胞吞实验,混合 淋巴细胞反应,与内皮细胞的黏附实验,Transwe 下趋化因子的迁移实验等检 测DC吞噬、黏附、迁移等功能,并在共培养过程中加用Transwe 或阻断抗体来 进一步阐明γ δ Treg诱导免疫耐受性DC生成的机制。 结果:γ δ Treg与iDC共培养后能显著抑 LPS促进的iDC成熟,CD80、CD86、 CD40、HLA-DR表达水平显著下调,该抑制作用依赖于ICOS/ICOSL的结合,同时还 能显著抑 iDC的吞噬功能。yδ Treg与mDC共培养后能显著抑 mDC 的黏附功 能,以及向CXCL12的迁移功能,相应的CXCR4表达下调,而对CCR7无影响,对黏附 功能的抑制同样依赖于ICOS/ICOSL的结合。 与yδ Treg共