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第6章分子生物学研究法下;第6章 分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术 6.1 基因表达研究技术 6.2 基因敲除技术 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 6.4 基因芯片及数据分析 6.5 利用酵母鉴定靶基因功能 6.6 其他分子生物学技术;6.1 基因表达研究技术;1)表达序列标签测序(EST);2)基因表达系列分析(SAGE);第6章分子生物学研究法下;3)转录组高通量测序(RNA-Seq);6.1.2 RNA的选择性剪接技术;第6章分子生物学研究法下;第6章分子生物学研究法下;6.1.3 原位杂交技术;原理： 利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。 操作流程： 以经过标记的已知核酸分子为探针。 以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子。 在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交。 再对其探测。;;第6章分子生物学研究法下;6.1.4 基因定点突变技术;1)寡核苷酸定点突变;操作流程： 合成一段含有需要改变碱基的寡聚核苷酸引物。;2)重叠延伸PCR诱变法;第6章分子生物学研究法下;3)大引物PCR诱变法;第6章分子生物学研究法下;PCR介导的定点突变方法的优势： 突变体回收率高； 能用双链DNA作为模板，可在任何位点引入突变； 可在同一试管中完成所有反应； 快速简便； PCR介导的定点突变方法已成为定点突变的主要技术。;6.2 基因敲除技术;基因敲除为完全基因敲除和条件型基因敲除。 完全基因敲除 指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。 条件型基因敲除 指通过定位重组系统实现特 定时间和空间的基因敲除。 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统，酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统。 Cre/Loxp系统应用最为广泛。;1)完全基因敲除;第6章分子生物学研究法下;2)条件型基因敲除;第6章分子生物学研究法下;6.2.2 高等动物基因敲除技术;第6章分子生物学研究法下;6.2.3 植物基因敲除技术;6.3 蛋白质及RNA相互作用技术;将编码待测转录因子cDNA与已??酵母转录激活结构域(AD)融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。;第6章分子生物学研究法下;6.3.2 酵母双杂交系统;导入酵母细胞中使之表达带有DNA结合结构域的杂合蛋白，与报告基因上游的启动调控区相结合，将作为“诱饵”捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。 再将已知编码AD的DNA分别与待筛选的cDNA文库中不同插入片段相连，获得“猎物”载体，转化含有“诱饵”的酵母菌。 如果酵母细胞表达的“诱饵”蛋白与“猎物”载体表达的某个蛋白质发生作用，不同转录调控因子的AD和BD就会靠拢，激活报告基因表达。 分离有报告基因活性的酵母菌，得到所需的“猎物”载体，就能得到与已知蛋白质作用的新基因。;第6章分子生物学研究法下;6.3.3 蛋白质相互作用技术;2)免疫共沉淀技术(CoIP);3)GST及GAD融合蛋白沉降技术;GAD融合蛋白是由酵母转录调控因子(Gal4)的转录激活结构域(GAD)与植物色素相互作用因子(PIF3)构成。 将GAD与PIF3的不同区段相接成为诱饵，研究该重组蛋白在体外与光敏素B(phy B)与缺失N-37位氨基酸的突变体或光敏素(phy A)的相互作用。 光敏素B能与PIF3发生强烈的相互作用，超过30%的phy B被PIF3沉淀下来。 缺失N-37位氨基酸的phy B突变体及phy A只能与PIF3发生较弱的作用，约5%的phy A或约10%的N-37位氨基酸缺失突变的phy B被沉淀下来。;4)荧光共振能量转移法(FRET) ;常用的探针有3类： 荧光蛋白 一类能发射荧光的天然蛋白及其突变体。常见的有绿色(GFP)、蓝色(BFP)、青色(CFP)和黄色(YFP)荧光蛋白等。 有机染料 具有特征吸收和发射光谱的有机化合物组成的染料对。包括荧光素、罗丹明类化合物和青色染料Cy3、Cy5等。 镧系染料(金属染料) 一般与有机染料联用，分别作为FRET的给体或受体，以提高检测的准确性和信噪比。;6.3.4 染色质免疫共沉淀技术(ChIP) ;6.3.5 RNA干涉技术及其应用;siRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性RNA降解的重要中间媒介，它具有特殊的结构特征，即5?端磷酸基团和3?端的羟基，其两条链的3?端各有两个