转染细胞的稳定筛选方法和实验步骤.docVIP

可修改 欢迎下载 精品 Word 可修改 欢迎下载 精品 Word 可修改 欢迎下载 精品 Word 转染细胞的稳定筛选 1、药物筛选前的准备 药筛前应确定药物筛选浓度，不同细胞系具有不同的药物敏感度，因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度。药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般时间很短，只需要3-4天即可。 2、药物筛选注意事项 （1）药筛的时间 加药时间一般为转染后48h。但由于慢病毒表达较慢，因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法，加药时间一般为72h 空白对照 加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药，待空白对照中细胞全部死亡，转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完，但还需继续加药。 （2）换液 如果加药后，细胞死亡较多，需及时换液，以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡。另外，随着细胞的代谢，抗生素的活性会降低，因此，每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液。 3、克隆筛选注意事项 若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法，都应该选择带有荧光较强的细胞克隆，因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞，因此最好选择带有荧光较强的细胞。若是转染的质粒不带有荧光，那么只能盲挑。不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆后进行验证