SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质量pptPowe.pptxVIP

SDS电泳测定蛋白质相对分子质量;实验目的;实验原理;3. 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： 1gMr =K―bmR 式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。;仪器、原料和试剂; （3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr） 30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。 （4）10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。 （5）10%SDS溶液：SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。 （6）1%TEMED；; （7）10%过硫酸铵（AP）：现用现配。 （8）电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。 （9）样品溶解液：取SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度增加一倍配制）。用来溶解标准蛋白质及待测固体。 （10）染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。 （11）脱色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。;实验步骤;试剂名称;3．制备凝胶板： （1）分离胶制备：按表配制20ml 10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。 （2）浓缩胶的制备：按表配制10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合，再放置20—30min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。 ;4．样品处理及加样 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~1mg/mL，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1分钟，以消除亚稳态聚合。 一般加样体积为10－15μL（即2－10μg蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。 ;5．电泳 将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离较时，将电流调至20－30 mA。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。 6．染色及脱色 将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。;计算;注意事项 ;2．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。 ;思考题 ;9、青少年是一个美好而又是一去不可再得的时期，是将来一切光明和幸福的开端。。8月-218月-21Wednesday, August 25, 2021 10、人的志向通常和他们的能力成正比例。19:12:4819:12:4819:128