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第 PAGE 页码 页码页 / 总页数 NUMPAGES 总页数 总页数 页 NGS建库捕获试剂盒操作手册 上海迪赢生物科技有限公司NGS建库捕获试剂盒操作手册 版本：P001-00 2019年10月 本产品仅供科研使用，不用于临床诊断目的。上海迪赢生物科技有限公司 试剂组分 组分名称0102030405060708091011杂交捕获试剂盒-112131415171819Index引物试剂盒洗液2洗液3杂交液3探针保护液封闭液后PCR引物混合液Index引物（1-96）19.2ml57.6ml254.4ul48ul739.2ul96ul5ul/条15-25℃15-25℃-20℃-20℃-20℃-20℃-20℃末端修复加尾缓冲液末端修复加尾酶连接缓冲液连接酶接头混合液PCR混合液QU试剂前PCR引物混合液杂交液1杂交液2洗液196rxn652.8ul115.2ul1536ul960ul240ul4800ul288ul480ul662.4ul331.2ul76.8ml保存温度-20℃-20℃-20℃-20℃-20℃-20℃-20℃-20℃15-25℃15-25℃15-25℃文库构建试剂盒杂交捕获试剂盒-2上海迪赢生物科技有限公司 1.实验准备 1.1客户自行准备试剂：（1）无核酸酶水（2）80%的乙醇溶液（需现配现用）（3）纯化磁珠（4）PH8.0的LowTE溶液（10mM的Tris-HCL(PH8.0)，0.01mM的EDTA）1.2使用Nanodrop对抽提好的基因组DNA进行纯度检测。1.3使用Qubit对抽提好的基因组DNA进行定量。1.4使用0.8%的琼脂糖电泳或安捷伦4200对基因组DNA进行降解程度评估。1.5对于FFPE样本，建议采用QPCR方法定量可扩增DNA，如果采用Qubit定量，请根据样本的降解程度相应提高样本起始量，如果样本量充足，尽可能使用不低于200ng的DNA。1.6在一个新的PCR或1.5mLEP管中加入总量为10-200ng的DNA样本，用无核酸酶的水补足至50uL，放置于冰上备用。2.文库构建 2.1启动CovarisS220system：确保新鲜的去离子水超过Covaris槽上level12；事先预冷并脱气半小时。2.2转移50μl的DNA样本到CovarismicroTube，贴壁慢慢打出液体，小心不要在tube底部产生气泡。2.3在CovarisS220和M220的超声条件设置如下：仪器型号BathTemperature(°C)PeakIncidentPower(W)DutyFactor(%)S220710030M220207520上海迪赢生物科技有限公司 CyclesPerBurstTreatmentTime(s)10001302002052.4取42ul超声产物转移至PCR管中，在冰上加入6.8uL的末端修复加尾缓冲液（蓝盖1号管）和1.2uL的末端修复加尾酶（蓝盖2号管），吹打混合均匀。2.5放置于PCR仪上执行以下程序：STEP123Temperature（℃）30654Time30min30minHold2.6取出连接混合液（橙盖3号管）、接头混合液（棕盖5号管）和连接酶（橙盖4号管），按照下表所示，配置接头连接的反应体系：组分上步产物接头混合液连接混合液连接酶Nuclease-FreeWater总共2.7吹打混合均匀，瞬时离心。2.8放置于PCR仪上执行以下程序，同时取出磁珠室温孵育30min备用，用无核酸酶水配置足够体积（μl）502.516101.58080%的乙醇。STEP12Temperature（℃）254Time15minHold上海迪赢生物科技有限公司 2.9加入64ul的纯化磁珠，Vortex混合均匀。2.10室温放置5min，注意此时不要放在磁力架上。2.11放置于磁力架上静置澄清后弃上清液。2.12加入200uL的80%乙醇，静置30秒后弃上清。2.13加入200uL的80%乙醇，静置30秒后弃上清。2.14快速离心后用10uL的移液器弃去残余乙醇，室温放置1-3分钟，确保乙醇挥发干净，但不要干燥过度防止文库产量降低。2.15从磁力架上取下管子，加入14uL的无核酸酶水重悬磁珠，Vortex混合均匀，室温放置2分钟。再加入25uL的PCR混合液（灰盖6号管），3uL的EU试剂（棕盖7号管），8uL的前PCR引物混合液（白盖8号管），Vortex混合均匀。2.16按照如下PCR条件执行PCR扩增：STEemperature（℃）3798986572Time15minutes45seconds15seconds30seconds30secondsRepeatStep3throughStep5foratotalof7-11time