A重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则Biotechn.pptxVIP

外源基因表达产物的分离纯化A重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理； 采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点处于极端区域（pI≤5 或 pI≥8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10-8- 10-4 mol / L）； 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的； 径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。多种分离纯化技术的联合运用 在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心） 因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。10 外源基因表达产物的分离纯化B离子交换层析离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换介质的选择原则离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本原理 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。离子交换介质的基本性质离子交换剂的基本性能 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等； 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用 如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数 吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而解离下来 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的离子交换介质的基本性质离子交换剂的分类 阳离子交换剂：强酸型和弱酸型可电离的基团 磺酸基（-SO3H） 磷酸基（-PO3H2） 羧酸基（-COOH） 酚羟基（-OH） 阴离子交换剂：强碱型和弱碱型可电离的基团 伯胺基（-NH2） 仲胺基（-NHCH3 ） 叔胺基（-N(CH3)2） 季胺基（-N+(CH3) 3 ）离子交换介质的基本性质离子交换剂的分类强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换树脂： 最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物 离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大，因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换纤维素： 离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大 阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等 阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换葡聚糖： 离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的