猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳.pdfVIP

一、 原理 1. 超氧化物歧化酶（SOD） 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，SOD ）是一种能专一地清除超氧离子自由基 O - （2 ）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用因而在医药、化妆品及食品 工业等方面有了广泛的应用前景。 SOD 是一种酸性蛋白，对热、pH 和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子 的不同，可分为 Cu-Zn-SOD （二聚体，蓝绿色）、Mn-SOD （紫红色）和Fe-SOD （黄褐色） 三种。 SOD 催化下述反应：2H + +2O - → H O +O 。机体内O - 的过量和不足均对机体不利，SOD 2 2 2 2 2 对过量的O - 的及时清除保证了机体内O - 的含量相对的平衡。机体内的O - 形成可分为生理性 2 2 2 和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些O - 。例如：呼吸链中电子传递结果可 2 产生一些O - 。在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的O - 。过量的O - 如不 2 2 2 及时清除，会对细胞损伤。SOD 将O - 歧化为 H O 和O ，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过 2 2 2 2 氧化酶可催化或氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。 2. 有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质 本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取 SOD 并进行分离纯化。有机 溶剂沉淀法的基本原理：①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子 之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓 度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。常见 的有机溶剂有丙酮和乙醇等。 3. 邻苯三酚自氧化法测定酶活力 酶活性测定的方法有以下几种方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT 光还 原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。本实验 SOD 酶活性采用邻苯三酚自 氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50% 的酶量定义为 1 个酶单位。邻苯三酚自氧化法的原理：利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自 氧化，产生O - ，生成有颜色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色， 2 吸光度值与反应时间能在 3～4 min 内维持线性关系。加入酶液则抑制自氧化的速率，在325 nm 波长处测定吸光度值即可。 4. 蛋白质含量测定 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝 G-250 法测定。考马斯亮蓝 G-250 （Coomassic brilliant blue G-250 ）在游离状态下呈红色，与蛋白质结合后呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595 nm 波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围在 1～1 000 μ g。 5. SOD 同工酶分离鉴定 SOD 同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法，核黄 素（FAD ）经光照所产生的O - （氧自由基）能使氯化硝基四氮蓝（NBT ）有黄色的氧化型 2 转化为蓝色的还原型。由于 SOD 能够抑制O - 的作用，因此，电泳分离 SOD 后，凝胶上无 SOD 2 出应显示为蓝色，而有 SOD 处则无色透明，由此可鉴定 SOD 同工酶的酶谱（即同工酶的种 类数量、分子量大小分布及活性大小）。 二、 操作步骤 1. SOD 的提取 [1] 取新鲜猪血 20ml 于 50ml 离心管，6000r/min，10min 离心，去上层血浆，取下层红 血球粘稠液，然后加入 2 倍体积的 0.9%NaCl 溶