分子标记及其在植物遗传育种中的应用.pptxVIP

分子标记及其在植物遗传育种中的应用;;形态标记;细胞学标记;生化标记——贮藏蛋白和同工酶;分子标记;分子标记的分类（Staub等1996）;植物遗传研究中常用的分子标记;RFLP;酶切：3-5ug DNA，以10U内切酶酶切5小时 电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时 染色：EtBr染色20分钟 变性：0.25M HCl 20分钟，抽真空，水冼 印迹：加入0.4N NaOH，进行Southern 印迹 冲洗：以2×SSC 冼胶，风干;—杂交—洗脱;—放射自显影;RFLP探针;探针标记—随机引物法;RFLP标记特点;RAPD;Polymerase Chain Reaction-PCR;RAPD的操作;Step1 95℃ 2分钟 Step2 95℃ 15秒 Step3 36℃ 30秒 Step4 72℃ 45秒 Step5 GOTO Step2 46循环 Step6 72℃ 5分钟 ?;主要特点;DAF(DNA amplification fingerprinting)：;AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction);ISSR;共同优点： 在不需要知道所扩增DNA序列情况下，产生DNA片段的指纹； 需DNA量少，产生多态性丰富。 缺点： 对反应条件非常敏感，重复性差。;SCARs（Sequenced Characterized Amplified Regions）;微卫星标记(SSR);不同物种其重复序列及重复单位频率不同。 通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNA SSR(1-4bp)的搜索,发现： (AT)ｎ最丰富,然后依次是: (A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT) n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。 同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大。;SSR的功能;两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据两端序列设计一对特异引物，通过PCR将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长度多态性。 不同材料重复次数的不同，导致了SSR长度的高度变异性。;SSR分子标记的创制;Cross-species SSR;SSR的操作;混合后，进行PCR扩增： Step1 95℃ 2分钟 Step2 95℃ 30秒 Step3 56℃ 30秒 Step4 72℃ 60秒 Step5 GOTO Step2 31循环 注：SSR引物退火温度在52-65 ℃ 不等。;SSR的特点：; 相对的物种专一性； 由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用较高，耗时长； 实际分析时一般每次只分析单个位点； 不同??物退火温度不同，需要探索。;SSR的检测;银染检测程序;AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism);DNA MseI -MseI MseI -EcoRI EcoRI -EcoRI MseI -MseI片段环化，不利小片段扩增； EcoRI -EcoRI 引物的退火温度高； MseI -EcoRI 片段优先扩增 ;接头序列;M00:5-GATGAGTCCTGAGTAA-3； P00:5- GACTGCGTACCAATTC-3; E00:5-GACTGCGTACCAATTC-3; MseI-primers +3: 5-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3‘ EcoRI-primers +3: 5-GACTGCGTACCAATTCNNN-3‘ PstI-primers +3: 5-GACTGCGTACATCGAGNNN-3‘; AFLP技术的特点;（4）AFLP分析用样量少（0.05-0.5 ?g DNA），而且对模板浓度的变化不敏感。 （5）由于特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，可靠性高。 （6）引物在不同物种间是通用的，可用于没有任何分子生物学研究基础的物种。 （7）银染技术具有快速、方便的特点，在1-2天内可以得到指纹。;AFLP操作具体包括三个步骤： 1. 酶切--连接； 2. PCR扩增，使目的序列扩增到0.5～1μg； 3. 电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。 对于基因组较大的物种，需要进行两步扩增—预扩增和选择性扩增。;模板DNA的酶切与连接;