全式金蛋白表达与纯化的实验.pptVIP

1-S 1-FT 2-S 2-FT 样品1：0.5 mM EDTA 样品2：无EDTA 全式金蛋白表达与纯化的实验 蛋白杂带多 洗脱条件不合适——咪唑浓度、pH值 梯度洗脱 非特异性结合 上调初始咪唑浓度 β-ME 非离子型去垢剂、甘油、NaCl…… 蛋白不完整——蛋白降解、提前终止（N端）、二级翻译起始（C端） 低温，蛋白酶抑制剂 重新构建 填料过多 全式金蛋白表达与纯化的实验 无初始咪唑 10 mM 初始咪唑 填料过多 全式金蛋白表达与纯化的实验 表达定位 菌液 离心 菌体 细胞总蛋白 培养基组分 悬菌，渗透压休克 菌体 细胞周质组分 悬菌，裂解，离心 胞质可溶组分 沉淀 溶解，离心 胞质不溶组分 沉淀 全式金蛋白表达与纯化的实验 沉淀 上清 全菌 可溶表达 沉淀 上清 全菌 包涵体 全式金蛋白表达与纯化的实验 常见问题与实验例 无表达或表达量低 蛋白不可溶 蛋白纯化障碍 全式金蛋白表达与纯化的实验 无表达或表达量低 载体-菌株搭配不当 摸索最佳的组合 载体 启动子 菌株 pGEX tac BL21 pMal tac BL21 pET T7/T7lac BL21(DE3) BL21(DE3)pLysS Rosetta(DE3) OrigamiB(DE3) pEASY T7lac 同上 全式金蛋白表达与纯化的实验 无表达或表达量低 稀有密