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抗汞引起肾细胞凋亡研究论文 【摘要】目的探讨血红素氧合酶-1（HO-1）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法64只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、单纯染汞组、HO-1诱导组和HO-1抑制组，每组16只。先分别腹腔注射生理盐水、空白液、血晶素、锌原卟啉Ⅸ（ZnPPⅨ）预处理，8h后处死各组内半数鼠取肾查HO-1表达水平与活性，余鼠除对照组注射生理盐水外，其余3组均腹腔注射HgCl2（2mg·kg-1），24h后检测血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）及肾内总抗氧化能力（TAOC）、丙二醛（MDA）、Bcl-2蛋白表达水平与细胞凋亡指数（AI）。结果与对照组比较，单纯染汞组TAOC降低而MDA、Cr、BUN、Bcl-2表达水平和AI均明显增加（P 【关键词】血红素氧合酶-1;肾;汞;凋亡;大鼠 氯化汞（HgCl2）是一种肾毒性药物，常用于制作急性肾功能衰竭的动物模型。近年研究揭示，汞能促进细胞线粒体产生大量H2O2等活性氧，后者进一步诱导的细胞凋亡在汞所致的急性肾衰中起着重要作用［1-2］。血红素氧合酶-1（HO-1）是一种抗氧化酶，广泛参与各种组织细胞应对氧化应激时的防御机制，是机体拮抗氧化应激损伤最重要的内源性保护物质，但HO-1能否抑制汞介导的肾细胞凋亡及急性肾损伤罕见报道。为此，我们拟应用血晶素与锌原卟啉Ⅸ（Zn-PPⅨ）分别特异性诱导与抑制HO-1，以探明HO-1对HgCl2引起大鼠肾细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。 1材料与方法 1.1药品与试剂 血晶素、ZnPPⅨ为Sigma公司产品。肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（TAOC）、兔抗鼠多克隆HO-1IgG抗体及Bcl-2IgG抗体、SABC免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂等均购自武汉博士德生物工程有限公司。TUNEL法凋亡检测试剂盒购于Boehringer公司，其它试剂均为分析纯。 1.2动物分组与标本采集 选用健康雄性Wistar大鼠64只（体重250～310g），随机分为4组:对照组、单纯染汞组、HO-1诱导组和HO-1抑制组，每组16只。预先分别给各组大鼠腹腔注射等量生理盐水、空白液（由0.1mmol·L-1NaOH和0.1mmol·L-1PBS液按体积比1∶24配制而成的混合溶液）、溶于空白液中的血晶素（30mg·kg-1）及ZnPPⅨ（20mg·kg-1），8h后，每组均任挑8只处死，取肾脏，一部分肾置于4%的中性甲醛液中固定作HO-1免疫组化染色，其余部分于-80℃保存待测HO-1活性。余鼠除对照组经腹腔注射等量生理盐水外，其余3组均经腹腔注射HgCl2（2mg·kg-1）溶液，动物自由进食饮水，24h后各组大鼠经2%戌巴比妥钠40mg·kg-1腹腔注射麻醉，开腹经下腔静脉抽血检测肌酐（Cr）、尿素氮（BUN），然后迅速摘出肾脏，取部分肾组织置于4%的中性甲醛液中固定，剩余肾组织于-80℃保存待测各项生化指标。 1.3免疫组化检测 取上述甲醛液固定肾组织，常规石蜡包埋切片（厚6μm），二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，于1g·L-1TBS中微波修复抗原10min，再置于3%H2O2中15min，灭活内源性酶，PBS液反复冲洗3次，采用SABC法按试剂盒说明书分别滴加HO-1或Bcl-2抗体（抗体滴度均为1∶200），DAB显色，封片，400倍镜下随机选择5个不重叠视野观察肾小管上皮细胞，胞浆见棕色颗粒者为阳性染色细胞。HO-1蛋白表达量采用CD-8病理彩色图像分析系统测定平均光密度值表示，Bcl-2蛋白表达量采用阳性染色指数（PI）表示，PI（%）=阳性染色细胞数/视野内所有细胞数×100%。 1.4生化指标检测 血Cr、BUN分别采用苦味酸法和二乙酰法，按试剂盒说明书测定。肾组织TAOC和MDA采用化学比色法，操作按试剂盒说明书进行。另取各肾组织标本约0.5g，加蔗糖Tris缓冲液制成组织匀浆，差速离心法分离微粒体，考马亮蓝法测定蛋白浓度，根据HO-1降解血红素生成胆红素的原理，参照何洁［3］的方法测定HO-1活性，以1mg蛋白1h催化血红红蛋白降解生成胆红素的量表示肾组织HO-1活性（nmol·mg-1·h-1）。 1.5TUNEL法检测细胞凋亡 肾组织经4%中性甲醛液固定过夜，脱水，透明，石蜡包埋，切片（厚6μm），置于包被有多聚赖氨酸的载玻片上，严格按试剂盒说明书进行操作，最后用苏木素复染细胞核，400倍光镜下观察，胞核染成棕黄色者为凋亡细胞，每张切片选10个不重叠视野，每个视野连续计数100个肾小管上皮细胞，以凋亡细胞所占的百分比作为凋亡指数（AI）。 1.6统计学