常用的分子生物学基本技术和复习总结.pdf

常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本 技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因 突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室 度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（ probe）, 待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA 和细胞总RNA。核 酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性 互补的已知DNA 或RNA 片段。根据其来源和性质可分为cDNA 探针、基因组探针、寡核苷 酸探针、RNA 探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA 固定于固体基质（硝酸纤维素膜或 尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA 或RNA 变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA 或RNA 探 针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品， 可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷 贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假 阳性。 印迹杂交（blo ing hybridization） Southern 印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA 片段，将凝胶上的DNA 变性并 在原位将单链DNA 片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对 应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子 的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及 限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern 印迹杂交:由Southerm 印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二 醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA 分子 的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。 差异杂交（differential hybridization） 是将基因组文库的重组噬菌体DNA 转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA 探针 （如：转移性和非转移性癌组织的mRNA 逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的DNA 杂交， 分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生 物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人）， 则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左右），价值不大。 cDNA 微点隈杂交（cDNA microarray hybridization） 是指将cDNA 克隆或cDNA 的PCR 产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上（如： 尼龙膜或活化的载玻片）以微点阵，然后用混合的不同DNA 探针与微点阵上的DNA 进行杂 交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交 技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服 保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。 寡核苷酸微点隈杂交（oligonucleotide microarray hybridization） 是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共价结合于支持物表面，与平均长度为 20-50nt 的混合RNA 或cDNA 探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显 微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA 的检测，以区分基因家族不 同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较 大、成本较高、速度较慢等弱点。 液相杂交（solution hbridization） 指使变性的待测核酸单链与放射笥核素标记的已知的酸单链（探针）在溶液中保温，使之形 成杂交复合物。反应结束后，用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交双链分开，然 后结膈后在杂妆分子中的探针量，就可推算出被测的核酸量。 递减杂交（subtractive hybridizatio） 是利用两种来源一致而功能不同的组织细胞提取mRNA （或逆转录成的cDNA）,在一定的条 件下以过量的驱动mRNA 或cDNA 与测试的单链cDNA 或mRNA 进行液相杂交，通过