2013年发酵工程实验讲义.docxVIP

- - PAGE # - - - PAGE # - 实验一正交实验设计法优化酵母菌的培养基 一.实验目的： 掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法， 学会对已确定菌种确定实 验室发酵工艺。 二?实验原理 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。 由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以 均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。 三.仪器与试剂 1?仪器设备 全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电磁炉。 试剂 葡萄糖，蔗糖，酵母膏， KHPO 四?实验方法 培养基的配制(见表1,2) 表1 正交表试验设计 因素水平 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KHPQ 1 1.0 0.0 0.5 0.5 2 2.0 1.0 1.0 1.0 3 3.0 2.0 2.0 2.0 表2 正交表实验方案 编号 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KH2PQ 生物量 (QD (A) (B) (C) (D) 1 (1) (1) (1) (1) 2 (1) (2) (2) (2) 3 (1) (3) (3) (3) 4 (2) (1) (2) (3) 5 (2) (2) (3) (1) 6 (2) (3) (1) (2) 7 (3) (1) (3) (2) 8 (3) (2) (1) (3) 9 (3) (3) (2) (1) 将上述培养基配制好以后，每 250 ml三角瓶装入培养基 100 ml，于121 C下灭菌 30 min，冷却。 冷却后接种(接种量为 5 %)，置于28C培养箱进行培养。 测0D值：将接种24 hr后时间的菌悬液摇均匀后于 560nm波长、1cm比色皿中测 定0D值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将 0D值填入表2 通过对正交实验所得数据进行分析，最终确定最佳培养基的组成。 五．思考题 比浊计数在生产实践中有何应用价值 ? 本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定 大肠杆菌生长的0D值，你将如何选择波长？ - - PAGE # - 实验二 淀粉酶的固态发酵实验 一.实验目的 了解和掌握微生物在发酵过程中淀粉酶活力、 还原糖和蛋白质浓度的时间变化曲线和测 定方法。 二?基本原理 淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解 a- 1, 4-葡萄 糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下，还原糖与 3、5-二硝基水杨酸共热，3、5-二硝基水 杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。 在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系， 可在722型分 光光度计540 nm波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原 糖的含量，从而求出淀粉酶的活力。 三.培养基及试剂 培养基 培养基（250mL）:麸皮7g，面粉0.5g, NaNOs 0.15g,营养盐6.5mL , pH自然。 营养盐配方（g/L ） : KHPQ3.0 ; （NH）2SQ2.0 ; Cacl 2 0.5 ; MgSO7H2。0.5 ; Cocl 2 0.003 ; FeSQ .7H 2O 0.0075 ; ZnSQ 0.002 ; pH5~6。 试剂 （1） DNS溶液的配制 酒石酸钾钠182g溶于500mL水中并加热，然后依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g ,2mol/L 的NaOH 262mL苯酚5mL亚硫酸钠5g搅拌溶解后定容至 1000mL存于棕色瓶中，放置 7-10 天备用。 （2） 考马斯亮兰G — 250溶液 称100mg考马斯亮兰 G—250,溶于50ml 95%的乙醇后，再加入 120ml 85%的磷酸，用 水稀释至1升。 （3） 0.2M磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液（ pH6.0）缓冲液 吸取 12.3mL 0.2 的 Na2HPO4 和 87.7mL 0.3mol/L NaH2PO4 混合均匀即得 pH6.0 的 Na2HPO4- NaH 2PO4 缓冲液。 四?实验方法 1淀粉酶活的测定 参照Bernfeld法。取适当稀释的粗酶液 0.5mL加到0.5mL2%可溶性淀粉液中（pH6.0 , 0.2mol/L磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液配制 ），于50C水浴反应10min ,用DNS法测定产 生的还原糖。 CK 样品1 样品2 样品3 底物（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液（mL） 0 0.5 0.5 0.5 50 C水浴准确反应 10min DNS (mL) 3 3 3 3 酶液（mL） 0.5 0 0 0 置于沸水中加热反应 10min 蒸馏水 加蒸馏水至20. 5mL,摇均后静置10min 550nm处测OD值 0 淀粉酶活力（IU/g干培养基）：本实验条