荧光钙离子测定常用技术.docVIP

荧光钙离子测定常用技术 钙离子测定技术得益于两种近代实验技术，一是钙激活蛋白及荧光指示剂(或称荧光探针)，二是荧光检测及成像分析，这些技术的日臻成熟使我们能够观察到许多与钙离子浓度变化有密切关系的亚细胞现象。近年来，数字CCD成像荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、多光子扫描显微镜、流式细胞仪等技术的发展，使我们不但能够精确地测定出钙离子浓度的变化，还可以得出准确的亚细胞水平空间定位。 一、荧光钙离子测定常用技术 1、荧光显微镜测定法 是一类以荧光显微镜检测为基础的测量技术，可用来分析单独的完整活细胞中钙离子的分布和功能分子动力学。然而，钙离子指示剂的性质易受细胞内环境(如pH)的影响，而且在多种细胞内现象中可见许多分子的浓度、分布、功能会同时或相应地发生一系列变化，为了研究这些细胞内现象的机制并排除测量准确性的干扰，目前多采用多参数分析。 (1)多参数数字化荧光显微镜系统(Multi-parameter digitized video microscope) 多参数数字化荧光显微镜系统可允许观测单一活细胞被多种荧光指示剂标记的情况，对细胞内特定物质(细胞参数)发生特异性荧光反应。组成该系统的几个主要部分是:装有相差或微分干涉相差的倒置(或正置)荧光显微镜、CCD数码相机(一般为高速、高灵敏度冷CCD)、可进行荧光钙离子浓度测定的图像工作站，荧光激发光源采用氙灯或汞灯，也有用激光的情形。在荧光激发光路上放置有滤光片转轮，由软件经开关装置控制不同激发波长滤光片的转换，见图1。CCD相机相当于一个检测器起到荧光信号检测和图像采集双重作用，采集到的荧光强度信号与钙离子浓度成正比，经软件分析得出细胞内钙离子浓度，钙离子浓度的基本计算方法见下式: ?单波长测定 [Ca2+]=Kd(F,Fmin)/ (Fmax,F) 式中Kd为荧光剂与Ca2+形成复合物的解离常数。Fmin和Fmax为最小荧光强度和最大荧光强度。 ?双波长测定 系用比值(Ratio)信号来计算细胞内游离Ca2+浓度，不必校正。即: [Ca2+] = Kd(Fd/Fs)(R,Rmin)/ (Rmax,R) 式中Fd和Fs分别表示荧光剂没有结合Ca2+和被Ca2+饱和时在340/380 nm(对于Fura-2)处的荧光强度;R为实验观察到的荧光比值;Rmin为细胞内荧光剂最小量结合Ca2+时的荧光比值，Rmax为胞内荧光剂被Ca2+饱和时的荧光比值。 (2)激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope，LSCM) 用常规荧光显微镜检测时，空间分辨率常受到部分处在焦点外的荧光信号造成的图像模糊所限制，背景荧光过强会降低图像对比度和清晰度，而纵向分辨力也不尽理想;每次观察是以焦平面作为对比度最好的层面，观察到的荧光是整个物质厚度的荧光强度之和，这样会导致量化测量的错误，特别是分析包含多层细胞的标本时会受到背景信号的干扰，激光扫描共聚焦显微镜的发明极大地克服了这种缺点。 LSCM是通过移动扫描点采集图像，并通过与扫描焦点处共聚焦位置的针孔收集发射的荧光信号，排除了焦点外荧光，从而可提供更高的垂直和水平的空间分辨率。LSCM 能够产生薄而且不模糊的光学层面，提供对感兴趣的参数区域进行三维空间重建成像的可能，理论上讲能提供更准确的功能离子浓度值[3]。初期LSCM 最重要的机械限制是在激发波长和时间分辨率上缺少变化，由于使用的光源通常是氩离子或氩氪激光激发波长范围受限，后来有了UV激发激光器这一问题。 (3)双光子激发的激光扫描显微镜(Two-photon excitation laser scanning microscope，TPLSM) 双光子激发是指同一个荧光探针分子同时被两个独立的光子激发，由于激发波长的能量和其波长成反比，如果激发波长加倍，能量就降至一半。如果两个独立的光子同时激发靶荧光素，实际的激发能量在理论上相当于一个光子在一半的波长激发，因此可使用长波光激发一般在紫外范围内激发的染料[4]。长波长激发具有光损害和细胞毒性低及受背景或溶液的散射限制小并能更深地进入标本等优点，有利于脑片、皮肤等较厚标本的钙离子检测。 (4)时间分辨荧光存留时间成像显微镜(Time-resolved fluorescence lifetime imaging microscopy， TRFLM) 用TRFLM分析功能性离子和常规的荧光显微镜有所不同，存留时间(lifetime，τ)是指荧光分子处在激发状态没有返回基态之前的时间，当两种不同τ值的荧光复合物用短脉冲激发时，激发分子发出的荧光与每个τ的长度有时间依赖性。尽管τ值不受散射、背景的衰减特性、光路长度、荧光素数目(浓度)、光漂白、控制荧光强度测量等其他因素影响，但