ELISA试验基本步骤及材料及试剂.docx

ELISA试验基本步骤以及学习资料以及试剂 ELISA试验基本步骤以及学习资料以及试剂 PAGE / NUMPAGES ELISA试验基本步骤以及学习资料以及试剂 E L I S A 基 本 步 骤 和 主 要 试 剂 、 材 料 注意：本步骤为间接 ELISA 步骤 一 主要步骤 包被 取所要包被的物质，提早设计好所需浓度，依据包被孔数计算所需包被物的量， 用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中。 包被条件：两种选择：一是将 ELISA 板直接置 4℃留宿；也能够先置 37℃孵育 2 小时再转入 4℃留宿。 清洗 包被结束后弃偷换被液，用 PBST进行清洗，方法为 PBST加满每孔，静置 5-10m in ，弃掉洗液，从头加满，重复清洗 3-5 次，最后拍干 ELISA 板等候下一步关闭。 关闭 常用 10%小牛血清，取第 2 步的 ELISA 板加关闭液至每孔，体积起码为所加包被 液的两倍。关闭条件也有两种选择： 直接置于 4℃留宿，或许置于 37℃温育 2-4h ，具 体何种条件不一样物质的 ELISA 可能不一样。 清洗 关闭结束的 ELISA 板进行清洗，方法同步骤 2。最后拍干等候加入一抗。 加入一抗 一抗即为你要检测的物质， 一般加以前需要稀释， 详细稀释倍数不一样实验 不一样需 要自己探索。一抗样品一般用包被液稀释，稀释到所需浓度后加入到相应孔中。反响 条件为 37℃孵育 2h。 清洗 详细同步骤 4。 7 加相应 HRP-标志的商品化二抗 加相应的商品化 HRP-标志的二抗（如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗），一般 也用关闭液稀释，稀释倍数参照二抗说明书。将稀释好的二抗加入各孔， 37℃反响 1 -1.5h 。 清洗 详细同步骤 4。 显色 常用 OPD作为显色底物， 但 OPD致癌，也实用 TMB作为底物，，这里只介绍前者。 显色需要配置显色液，详细方法为：在步骤 8 进行到一半使配置显色液，为 10ml 底 物缓冲液加 0.015g OPD 粉末（实质操作因为 OPD有毒不方便称量故只要略微加入一 点即可），等候 OPD完整溶解。待步骤 8 达成后取 150ul 3% 过氧化氢溶液加入以前配 置的 10ml 溶液中混匀，马上将此显色液分加至 ELISA 各孔中。而后将 ELISA 板置于 3 7℃ 反响约 10min。 停止 将 ELISA 板拿出，每孔加停止液 （2mol/L 硫酸溶液）停止反响，马上到酶标仪上 读数（ OPD为底物是读数波长为 490nm，TMB为底物时波长为 450nm）。 二 资料、试剂 1 ELISA 板 专用于 EILSA的产品称为 ELISA 板，国际上标准的微量滴定板为 8× 12 的 96 孔式， 需要购置。常用聚苯乙烯和聚氯乙烯资料。注意：聚苯乙烯资料当前只有入口，特色 是孔大，加满约 300ul ，此时实验中所加各试剂（包被液、一抗、二抗、显色液、终 止液等）均为 100ul 体积。而聚氯乙烯多为国产，孔较小，加满约 200ul ，此时各试 剂只要加 50ul 体积即可。 各试剂配制 1）包被液（ PH6.3 的碳酸盐缓冲液） 无水 NaHCO3 SW 100ml 完整溶解至 4℃ , 一周内使用 2）PBST配方 NaCl KCl KH2PO4 TW-20 SW 1000ml 底物缓冲液 Na2HPO4 柠檬酸 DW 200ml 不需灭菌， 4℃保留 4）3% H2O2 30%H2O2 100ml SW 900ml 5）显色剂 底物缓冲剂 10ml 3%H2O2 150ul OPD 15mg 此中 H2O2 最后加 6）停止液 浓硫酸： SW = 1:8 浓硫酸迟缓加入到 SW中，并搅拌散热 三 注意事项 包被 所谓 37℃反响，一般取一个 37℃的水浴锅，在水面放一较大泡沫板，将 ELISA 板置于泡沫板上即可，其余步骤的 37℃反响操作同此； 整个 ELISA过程中全部需要较长时间等候的步骤（包被、关闭、加一抗孵育、加 二抗孵育）均需要将 ELISA 包起来再放入冰箱或水浴锅中，一般可直接用一次性 EP 手套套起来即可。 清洗 最惯例的清洗步骤是清洗 3 次，每次间隔 5min，详细实验可能会微调，清洗次数 能够 3-6 次不等，间隔 5-10min 不等； 每次清洗后要将 ELISA 板尽可能拍干后在进行下一步操作，特别是每个清洗步骤 的最后一次清洗要尽可能拍干，拍干可在纱布、吸水纸长进行，也能够购置洗板机。 显色 配制显色液时 3%过氧化氢必定要最后加入，加入混匀后马上分装到 ELISA 板中， 即在加过氧化氢前要完整达成清洗的操作； OPD一般在倒数第二次清洗前加入，要留有约 10min 时间以保证 OPD完整溶解。 其余未