用正交法测定几种因素对酶活力地影响实验报告材料.docVIP

word word PAGE / NUMPAGES word 用正交法测定几种因素对酶活力的影响 一、前言 正交实验法 正交实验法就是利用排列整齐的表- 正交表来对试验进展整体设计、综合比拟、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。正交表能够在因素变化X围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。 正交实验设计包括两局部内容:第一，是怎样安排实验;第二，是怎样分析实验结果。 酶活力 酶活力〔enzyme activity〕也称为 酶活性，是指 酶催化一定 化学反响的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一 化学反响的速度来表示，酶催化 反响速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定 酶促反响的速度。 酶促反响速度可用单位时间内、单位 体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反响体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少局部，不易准确检测，而产物如此是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。 二、实验目的 1.学习并掌握正交法应用原理。 2.采用正交法测定多种因素对酶活力的影响。 三、实验原理 酶促反响常常同时受到多种因素(包括激活剂和抑制剂等)的交互影响，可采用正交法进展综合研究，即通过少量试验收到更好的效果：多快好省。本实验以正交法同时测定[S]、[E]、温度和pH值对trypsin活性的影响，以求得酶活最大时相应影响因素的最优值(水平)，并借此初步掌握正交法的使用。 四、实验器材和试剂 实验器材： ①试管 ②漏斗 ③温度计 ④吸管 ⑤恒温水浴锅 ⑥分光光度计 实验试剂： ①2%血红蛋白液(Hb) ②15%三氯醋酸液(TCA) ③trypsin酶液 ④巴比妥缓冲 液(pH 7, 8, 9) ⑤考马斯亮蓝染液 五、实验操作 1.实验设计 本实验为四因素三水平(总试验次数34=81)，可选用L9正交表〔仅需9次试验)，展开后其特性为均衡搭配 〔1〕每列中水平数1、2、3出现次数一样，均为3次； 〔2〕每两列的横行数对(1-1/1-2/…/3-2/3-3)各出现一次。 列号 试验号 1 2 3 4 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 试验号 试剂/ml 1 6 8 2 4 9 3 5 7 2%血红蛋白液 缓冲溶液 pH7 pH8 pH9 pH8 pH9 pH7 pH9 pH7 pH8 37℃预温5min 50℃预温5min 60℃预温5min 酶液 37℃反响10min 50℃反响10min 60℃反响10min 〔1〕各试管编号，分别参加对应容量的底物(2% Hb)和相应pH值的缓冲液，混匀； 〔2〕同温处理的3支试管同时预温5min； 〔3〕各试管依序分别参加对应容量的trypsin酶液(统一加样时间间隔)，混匀； 〔4〕同温处理的3支试管置对应恒温水浴中反响10min； 〔5〕各试管依次参加15%三氯醋酸液2ml，混匀以终止反响； 〔6〕非酶促对照：另取一试管，先参加2%血红蛋白液与pH8缓冲液，再加15%三氯醋酸液，混匀静置10min后再参加酶液； 〔7〕上述各管反响液室温静置15min后过滤，取滤液待测酶活； 〔8〕酶活测定(考马斯亮蓝法，标准曲线制备略)：取试管假如干支编号，分别参加对应的样品滤液与考马斯亮蓝液，混匀，室温静置3min，以非酶促对照管为空白，于波长595nm比色测定。 将各管测定所得光密度值对应填入表格，分别算出各因素一、二与三水平的试验结果总和Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，并分别取其平均值计算相应的极差(各列中最大与最小值之差)；比拟各因素极差的大小以评估各因素对酶活的影响，并对酶活最高时的各因素水平作一直观分析。 六、实验结果与数据处理 1.实验数据： pH值 温度 pH7 pH8 pH9 测量值 平均值 测量值 平均值 测量值 平均值 37℃ 50℃ 60℃ 2.实验数据处理分析： 列号 试验号 1 [S]/ml 2 [E]/ml 3 温度/〔℃〕 4 pH 试验结果 A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 37 2 50 3 60 2 50 3 60 1 37 3 60 1 37 2 50 1 7 2 8 3 9 3 9 1 7 2 8 2 8 3 9 1 7 Ⅰ〔一水平试验结果总和〕 Ⅱ〔二水平试验结果总和〕 Ⅲ〔三水平试验结果总和〕 Ⅰ/3 Ⅱ/3 Ⅲ/3