荧光分析法基本原理和定量分析方法课件.pptVIP

第三节 荧光分光光度计 四个部分 —— 激发光源、样品池、双单色器系统、检测器 特殊点 —— 有 两个单色器 ，光源与检测器通常成 直角 单色器 ： 选择激发光波长的 第一单色器和选择发射光 ( 测 量 ) 波长的第二单色器 光源 ： 氙灯、高压汞灯、激 光器 ( 可见与紫外区 ) 检测器 ： 光电倍增管 44 荧光光谱（ fluorecence spectrum ）： 固定激发 光波长为最大激发波长 ，而让荧光物质发射的 荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长 下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强 度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。 荧光物质的最大激发波长（ l ex ）和最大发 射波长（ l em ）是鉴定物质的根据；也是定量 测定最为灵敏的条件。 45 46 荧光光谱的普遍特性 1. 斯托克斯位移 (Stokes shift): 激发光谱与发射光谱之间的波长差值；荧光发 射波长总是大于激发光谱波长。 室温下菲的乙醇溶液荧光光谱 47 荧光光谱的普遍特性 2. 荧光光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长 的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单 重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而荧光 发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状 与激发波长无关。 3. 荧光光谱与激发光谱的镜像关系 激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。 48 100 80 60 F 40 20 0 200 V=4 V=3 V=2 V=1 V=0 a b 1 b 2 b 4 c 0 b 0 c 1 c 2 c 3 c 4 蒽的激发光谱（虚线） 荧光光谱（实线） b 3 280 360 ? E4 ? E3 ? E2 ? E1 440 520 nm S 1 ? 蒽的能级跃迁 b 4 b 3 b 2 b 1 b 0 c 0 c 1 c 2 c 3 c 4 ? E4 ? E3 ? E2 ? E1 V=4 V=3 V=2 V=1 V=0 S 0 49 二、荧光与分子结构 （一）荧光寿命和荧光效率 荧光寿命 (fluorescence lift time) ： 当除去激发光 源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的 1/e 所需的时间，用 表示。 ? f F e t ? F 0 1 / e ? e ? Kt f F / e ? F e 0 0 K ? f ? 1 K ? 1 ? K ? f ? K ? ? f F e 0 / F t ? Kt F 0 t ln ? F t ? f 50 F 以 l n 0 对 t 作图，斜率即为 1 ? f F t 荧光效率（ fluorescence efficiency): 指激发态 分子发射荧光的分子数与基态分子吸收激发 光的光子数之比，常用 ? 表 f 示。 发射荧光的光子数 ? f ? 吸收激发光的光子数 荧光效率与物质的分子结构和所处的化学环境 条件有关。 51 （二）有机化合物分子结构与荧光的关系 ? 物质产生荧光必须具备的条件： （ 1 ）物质的分子必须具有能够吸收紫外和较短 波长可见光的结构 （ 2 ）物质必须具有较大的荧光效率 52 1. 长共轭结构（芳香族化合物） 共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移 l em ? f 205nm l ex 278nm 0.11 286nm 321nm 0.29 356nm 404nm 0.36 53 2. 分子的刚性 分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰 撞失活的机率下降，荧光量子效率提高，荧 光长移。 ? ? 0 . 2 f ? ? 1 . 0 f 54 3. 取代基 ? 给电子基团使荧光增强；荧光波长长移。 ? 吸电子基团会减弱甚至破坏荧光。 ? 同 ? 电子体系相互作用小的取代基对荧光影响 不明显。 55 （三）荧光试剂 1. 荧光胺 l ? 275 、 390 nm l ? 480 nm ex em 2. 邻苯二甲醛 ( OPA ) l ? 340 nm ex l ? 365 nm ex l ? 455 nm em l ? 500 nm em 3.1- 二甲氨基－ 5 －氯化磺酰萘 4. 测定无机离子的荧光试剂 56 三、影响荧光强度的外部因素 1. 温度 温度增加，荧光效率和荧光强度下降。 2. 溶剂 随着溶剂的极性的增加，荧光物质的 π→π* 跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也 发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低。 57 3. 酸度 ? 具酸或碱性基团的荧光物质，在不同 pH 值时，其 结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。 NH 3 + OH - H + NH 2 OH - H + NH - 蓝色荧光 无荧光 无荧光 ? 利用金属离子与有机试剂生成配合物进行测定金 属离子时，配合物的稳定性和组成受溶液 pH 值影响