实验五--核酸琼脂糖凝胶电泳.docxVIP

精选文档 精选文档 可编辑 可编辑 实验五 核酸琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法， 具有操作方便、经济快速等优点。本实验学 习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯 DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的 一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。 DNA在碱性条件下（pH8.0 的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同 DNA分子片段由于分子和 构型不同，在电场中的泳动速率也不同。澳化乙锭（ EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧 光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目 的。但是EBM有致癌性，所以我们选用无毒，高灵敏度是 Ex Green染料，。此核酸染料在紫 外透照仪及可见光透射仪上均可使用。 ExGreen外观呈红色，与核酸结合后，可用 300 nm （紫外透射仪）激发。 ［琼厢力跖疑胶浓度与线性DMA分离范围参数 凝胶浓度(%) 线性DZA长度(bp〉 0.5 1000—30000 0.7 800—12000 1.0 500—10000 1.2 400?7000 1 .5 200—3000 2.0 50-2000 三、材料、仪器和试剂 、材料 大肠杆菌中提取的质粒 DNA 、仪器 电泳仪；台式离心机；恒温水浴锅；微波炉；紫外透射仪；照相机或者凝 胶成像系统 3、试剂 50 X TAEfe泳缓冲液：称取Tris 242g , EDTA 37.2g ,加入约800ml的去离子水， 充分搅拌溶解，加入 57.1ml 的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容至 1L ，室温保存。 6 X电泳上样缓冲液：0.25%澳酚蓝、40% (W/V )蔗糖水溶液，贮存于 4 ℃o (3)澳化乙锭(EB)溶液母液：将 EB配制成10mg/mL 。用铝箔或黑纸包裹容器， 贮存于室温即可。 (4)分子量标准 DNA ： DNA Marker 四、操作步骤 1 、制备 1% 琼脂糖凝胶 (大胶用 40ml ，小胶用 30ml) ：称取 0.7 g(0.5 g) 琼脂糖置于 锥形瓶中，加入 70 ml(50ml) 1 X TAE ,瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸 3次至琼脂糖全 部融化，摇匀，即成 1.0% 琼脂糖凝胶液。 注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的 2、胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽 (制胶槽 )洗干净，晾干，放入制胶玻璃板 .取 透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好， 形成模子。 将内槽置于水平位置， 并在固定位置放 好梳子。在冷却到 65 ℃左右的琼脂糖凝胶液中加入 Ex Green 染料( 10ml:1ul ) ，混匀后小 心地倒入内槽玻璃板上， 使胶液缓慢展开， 直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。 室温下静置 直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加 1X TAE 电泳缓冲液至没过胶板 1-2 mm为止。 注意： 必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则， 会造成电泳图像模糊不清。加热时如胶液 剧烈沸腾发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。 倒胶时，不要产生气泡，溶液温度太高 （＞60 ℃ ），会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子 浓度，影响电泳效果。 、 加样： 在点样板或 EP 管中混合 DNA 样品和上样缓冲液， 上样缓冲液的最终稀释倍 数应不小于 1X 。 用 10 ul 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内， 每加完一个样品， 应更换一个加样头，以防污染。加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。 （注意：加样前要先记 下加样的顺序 ） 。 注意： 加样时， 要把枪头插入到加样孔里，但是不要插穿加样孔底部凝胶， 保证样品尽 量在加样孔中而不外溢。 、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压 60-100V ，样品由负极 （黑色 ）向正 极（红色 ）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低当溴酚蓝移动到距离胶板下 沿约 1cm 处时，停止电泳。 5、电泳完毕后，取出凝胶 、观察照相：在紫外灯下观察， DNA 存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系 统拍照保存。 注意事项： 、操作时带一次性手套，避免 DNA 酶污染引起 DNA 降解。 、 及时更换电泳缓冲液， 电泳缓冲液在电泳槽中存放过， 多次使用后， 离子强度降低， PH 值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。 、 一般情况， 电泳电压 20V/cm ， 温度 30 ℃； 大分子量 DNA 链电泳， 温度应 15 ℃。 、电泳前样品勿受热，以免引起 DNA 变性。 、凝胶中 DNA 的上量要合适，太多会引起 DNA 条带模糊，太少又会引起条