《分子诊断》PCR-优质课件.pptxVIP

聚合酶链反应及其应用 ;重医医学学士（1979年，临床医学） 重医医学硕士（1986年，病理生理学） 重医医学博士（1994年，临床检验诊断学） 芝加哥大学博后（00-03年，分子肿瘤实验室） 电子邮箱 zhoulan0111@ ;本讲内容;1-1 基因扩增及其方式 gene amplification gene magnification ;1-1 基因扩增;2） 基因扩增的方式;;;1-3 PCR的定义;;;;;;; 利用DNA聚合酶催化一对引物间的特定DNA片段在体外实现快速、大量扩增的方法 也称：无细胞克隆技术 或：特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法 是一种模拟体内天然DNA复制过程的体外核酸扩增技术，是基因扩增技术的一次重大革新 ; 现已广泛应用到分子生物学研究、临床检测等各个领域。 优点： 特异、敏感、简便 自动化 快速、高效（数小时内可使模板扩增107～108倍） ;2-1 DNA的变性和复性 2-2 PCR标准反应体系及反应过程--三步曲 2-3 反应的结果 2-4 PCR的反应条件及其对PCR的影响 2-5 产物片段及其累积过程; 2-1 DNA的变性与复性; 1）标准反应体系（五要素） （1）DNA模板(template)：靶基因 （2）原料：dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP） （3）催化酶：耐高温的DNA聚合酶（如：Taq酶） （4） 一对引物（primer）：扩增序列的决定者 其与靶基因两侧序列互补 （5） Mg2+ 和 Buffer ;; 高温变性：在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板 低温退火：在低温（37～55℃）下，两条人工合成的寡核苷酸引物分别与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链 适温延伸：在耐热DNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以引物的3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链 ;;PCR原理示意图; 2-2 反应过程 ; 播放PCR短片; 1）每一条双链DNA模板，在一次热循环后就成了 两条双链DNA分子 2）每次循环产生的DNA均能成为下次循环的模板 3）每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物以指数形式（2n）迅速扩增 4）经过25～30个循环后， 理论上可使基因扩增109倍以上 实际上一般可达106～107倍（ why？？？） ; ;2-3 PCR的结果 30次循环后靶序列扩增的数量;将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭（EB)等染色，在紫外灯照射下可见到DNA的特异扩增区带 ;是一种荧光染料，可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下发出红色荧光 根据情况，可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB；有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min EB染色后，肉眼可见核酸电泳带的DNA量一般5ng 它是一种高诱变性的化学物质 SYBR-green 和 gelred 是毒性更小的染料;; 2-4 PCR的反应条件及其对PCR的影响;PCR操作程序 ① 向一微量离心管中依次加入双蒸水、缓冲液、Mg2+、dNTPs、引物、DNA模板和Taq DNA聚合酶 ②混匀后，离心数秒，使反应成分集于管底 ③加矿物油50～100μl于反应液表面，防蒸发 ④置反应管于PCR仪上，设置程序，进行热循环;1）模板：** 单、双链均可 **几乎不需要纯化 **但，必须了解靶基因两侧的核酸序列 **一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞或裂解病原体，再消化除去染色体的蛋白质以游离靶基因，便可直接用于PCR扩增 ** RNA模板提取时，要防止RNase降解RNA 注意：不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类  ; — 微生物 — 细胞：血痕、精斑、口腔拭子、阴道拭子、尿样、单根毛发、指甲削刮的碎屑、牙刷、琥珀中的昆虫、木乃伊 — 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 模板DNA的浓度： 0.1～2ug/100ul体系 *PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高 *但，模板DNA浓度过高，则致非特异性产物增加?;2）耐热的DNA聚合酶;例：经典的Taq DNA聚合酶的特性;良好的热稳定性： PCR混合