CFU检测方法分析和总结.docxVIP

附件 1： CFU 平板计数操作规范 准备工作 培养皿：培养皿用洗洁精洗涤，然后清水反复冲洗干净，确保无洗洁精残留，晾干。用双层报纸包好，121℃，30min 高压灭菌，冷却干燥后备用。 蒸馏水、刻度吸管（10mL、5 mL、1 mL）、18×180 试管、涂布器等所需物品报纸包好后，121℃，30min 高压灭菌，冷却干燥后备用。 培养基的配制（北京陆桥CM107 营养琼脂）。 确保配制时容器清洗干净。 培养基各成分称量准确无误。 培养基配制日期、名称、配制人员等标示清楚。 倒平板 火焰保护操作，确保无菌。 每个平皿中培养基的量为 20mL。 1.4.1 倒完后置超净台上，开风机吹 30min，（禁止开紫外灯），待平板凝固后用灭菌报纸包好倒置于恒温培养箱中 37℃空培 24h。 1.4.1 空培结束后，将平板置于冰箱内保存，待用。 平板计数 样品的制备 液体样品的制备：从发酵罐中取 100mL 发酵液于 250 mL 高型 烧杯中，置于磁力搅拌器上搅拌 2min，搅拌状态下，取专用的10 mL 刻度吸管沿烧杯壁插入烧杯至 50 mL 刻度线处，润洗3 遍后吸取发酵液 10 mL 置于的无菌含 50 个玻璃珠的 500 mL 三角瓶中，吹洗 3 次， 200rpm 摇床振荡处理 30min，既得 10-1稀释液。 固体样品的制备：准确称取样品 1.000g 于含 50 个玻璃珠的 500 mL 三角瓶中，加无菌水 100 mL，200rpm 摇床振荡处理 2h，即得 10-2 稀释液。 操作步骤 根据样品菌数选择合适的稀释度，确定稀释用试管的数量。 每支试管用 10 mL 刻度吸管加入 9 mL 无菌水。 事先将 1 mL 移液管装于调好的移液器上，将制备好的样品置于漩涡振荡器振荡 2min（准确计时），振荡完成后立即将 1 mL 刻度吸管插入试管中部，润洗 3 次后吸取稀释液 1 mL 于 9 mL 无菌水试管中，即得 10-2 或 10-3 稀释液. 更换刻度吸管，同样操作制成 10 mL 倍梯度的稀释液，直至最后的稀释度。 涂布：取最后稀释度开始涂布。样品重新振荡 1min（准确计时） 立即用 1 mL 刻度吸管插入试管中部，润洗 3 次后吸取稀释液 1 mL， 在火焰保护下将刻度吸管管尖靠于打开的培养基上，各放 0.1 mL 样品于五个平板中，剩余部分打回试管。取涂布器均匀涂布30s，至样品完全渗入培养基（涂布过程中培养基有涩感）。 同样操作共做 3 个连续的稀释度（稀释度由高到低），不同稀 释度更换刻度吸管和涂布器。 涂布完的培养皿做好标示（样品名称、稀释度、操作人）。 样品培养：将上述培养皿用报纸包好（减少水分蒸发，并防止污染），倒置于恒温培养箱中，选择样品所需培养温度培养至所需时间，可以计数。 菌落计数 通过菌落识别结合镜检，确定有效菌。 以出现 20－300 个菌落数的稀释度的平板为计数标准，统计有效活菌数目。当只有一个稀释度，其有效菌平均菌落数在 20－300 之间时，则以该菌落数计算。若有两个稀释度，其有效菌平均菌落数均在20－300 之间时，应按两则菌落总数之比值（稀释度大的菌落总数× 10 与稀释度小的菌落总数之比）决定，若其比值小于等于2，应计算 两者的平均值；若大于 2 则以稀释度小的菌落平均数计算。准确计数有效菌落数和杂菌数，每个稀释度 5 个培养皿菌落数之和为该稀释度有效菌落总数。 计算 CFU = 菌落数的平均值/10-n/0.1