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实验十 微生物鉴定中常用的生理生化试验 实验十 微生物鉴定中常用的生理生化试验 摘要 本次实验包括大分子水解试验、糖发酵试验和IMViC试验（吲哚、甲基红试验）三类试验，根据要求本实验使用六种培养基分别对所需菌种组合进行了大约24h的培养，之后按照实验要求进行各个试验。最后观察到了实验现象，了解了所用菌种鉴别的方法和原则。 关键词 微生物鉴定；生理生化试验；大分子水解试验；糖发酵试验；IMViC试验 前言 类的微生物有着不同的代谢类型，例如对一些物质的分解能力及分解代谢的产物的不同反映出他们不同的生理特征，这些特征可以用来对不同种类微生物进行鉴定和分类。因此可以对微生物的不同生化反应进行试验，以此证明微生物生理特征的多样性，证明微生物分类鉴别的依据。生理生化试验相比其他鉴别方法而言相对简便、快捷、经济实用，在一般的实验室中都可以进行，因此在微生物种类的初步鉴别中被广泛使用。 一、 实验目的 1、大分子水解试验 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统，掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 2、糖发酵试验 了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中的重要作用，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 3、IMViC试验 了解IMViC的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、 实验原理 在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。代谢过程主要是酶促反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内，称为胞内酶（endoenzymes）.许多细菌产生胞外酶(exoenzymes)，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下： 1、 大分子水解试验： 微生物对大分子如淀粉、蛋白质和油脂不能直接利用，必须依靠产生的胞外 酶将大分子物质分解后才能被微生物吸收利用。微生物的胞外酶（如淀粉酶、脂肪酶等）主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。将大分子物质分解的过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可以改变培养基的PH，使PH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。 2、 糖发酵试验： 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应。在肠道细菌的鉴定上尤其为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸和气体，有些细菌只产酸不产气。例如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（PH6.8）转变为黄色（PH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 3、IMViC试验 吲哚试验： 用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。 吲哚对二甲基氨基苯甲醛反应： 甲基红试验： 用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（PH6.3）转变为红色（PH4.2），即甲基红反应。尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个实验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上还是有价值的。大肠杆菌和产气肠杆菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养的后期仍能维持酸性PH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大约6。因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。 三、 实验材料 1. 菌种 （1）大分子物质水解试验 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌，普通变形杆菌。 （2）糖发酵试验 大肠杆菌，普通变形杆菌。 （3）IMViC试验 大肠杆菌，产气肠杆菌。 2.培养基 固体淀粉培养基，固体油脂培养基，葡萄糖发酵培养基（附德汉式小管），乳糖发酵培养基（附德汉式小管），蛋白胨水培养基