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重组质粒的转化（转菌） 重组质粒的转化 重组质粒的转化(热休克法) 本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2μl质粒即可）。 本流程以α-互补鉴定为例。适用于含有?-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。 ㈠试剂及材料: 1. IPTG溶液(异丙基硫代-?-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。 2. X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-?-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。 3. LB液体培养基（无抗生素）。 4. 含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin的LB培养板表面加入4μl 200mg/ml IPTG和16μl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。（注意：4μl 200mg/ml IPTG加上16μl 50mg/ml X-Gal不足以涂布整个平板表面，可同时加入含与平板相同抗生素的LB液体培养基100μl左右。） 5. 感受态细胞。 6. 42℃水浴。 7. 冰浴。 ㈡操作流程: 1. 准备LB/Amp/IPTG/X-Gal平板或者其它筛选用平板，使用前将平板预热至室温。 2. 从-80℃中取出冰冻的感受态细胞(如JM109)，?Z冰浴中约5min至刚刚融化。轻 轻晃动使细胞混匀，仍?Z冰浴中。 3. 离心连接反应管，吸取5~20μl连接体系至?Z于冰上的感受态细胞中。 4. 轻轻晃动使其混匀，?Z冰上30min。 5. 于准确调温的42℃水浴中热休克45~50sec，切勿摇晃、震动。 6. 速回冰浴2min。 7. 加入800μl已经预热到室温的无抗生素的LB液体培养基。 8. 摇菌:37℃×200rpm×1.5~2 h。 9. 铺板:将100μl转化体系均匀涂布于准备好的LB/amp/IPTG/X-Gal平板或者其它筛 选用平板（可将1ml全部铺板）。 10. 液体被吸收后倒?Z培养37℃×过夜。 11. 蓝白斑鉴定：?Z4℃下1~4h使蓝色充分显现，以便蓝白斑鉴定。白色菌落为带有 重组质粒的克隆。非α-互补鉴定的话，没有蓝白斑鉴定这步，过夜培养所产生菌落即为可能带有重组质粒的克隆。 重组质粒的转化(致敏法) 本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2μl质粒即可）。 原理：新鲜培养的细菌细胞遇到高效致敏剂时，其细胞表面会形成微小的孔洞，有利于外源DNA分子进入细胞内，从而形成转化。以下流程以博大泰克公司高效感受态细胞DH5α、BL21(DE3)、JM109等为例。 本流程以α-互补鉴定为例。适用于含有?-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。 ㈠试剂及材料: 1. IPTG溶液(异丙基硫代-?-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。 2. X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-?-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。 3. LB液体培养基（无抗生素）。 4. 含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin的LB培养板表面加入4μl 200mg/ml IPTG和16μl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。（注意：4μl 200mg/ml IPTG加上16μl 50mg/ml X-Gal不足以涂布整个平板表面，可同时加入含与平板相同抗生素的LB液体培养基100μl左右。） 5. 致敏感受态细胞。 6. 试剂A（随感受态细胞提供）。 7. 无菌水（随感受态细胞提供，自制亦可）。 8. 冰浴。 ㈡操作流程: