ELISPOT技术原理及其应用.pptVIP

这是震动所导致的斑点拖尾 4. 斑点变花或者“拖尾” 这是细胞趋化所导致的斑点变花 细胞在培养过程中震动导致斑点拖尾 大部分斑点清晰，但部分出现“拖尾”，这并非震动的原因 主要原因是DC所导致的细胞趋化作用 常见于多价刺激，没有固定的DC比例，有很大的个体差异 5. 透明板“空斑”问题 主要原因是粒细胞分泌或分解所至的酶解现象 PVDF膜板因底部是白色的膜，同时斑点更致密而几乎看不出来 改善方法 采用单价刺激物，多价刺激物时更容易出现 与PBMC分离的质量密切相关 采用预孵育法可大大减轻这一现象 我们自己的一个例子（透明板，PBMC，乙肝核心抗原蛋白） DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd. 达科为生物 DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd. 酶联免疫斑点Enzyme Linked ImmunoSPOT 达科为生物技术有限公司 朱义鑫 2005.11.30 Elispot实验结果（透明板）U-Cytech 公司 Elispot实验结果（PVDF板）U-Cytech 公司 ELISPOT技术起源与发展 细胞与细胞因子 ELISPOT技术原理 ELISPOT 和 ELISA的区别 ELISPOT的优点 第一部分：前言 1983年, CzerkinskySedgwick ：计数分泌抗体的 B 细胞； 1985年，More：NC板，改进显色底物，不再需要琼脂糖凝胶; 1988年，Czerkinsky et.al.: 首次将应用扩展到细胞因子检测领域，T cell IFN-γ; 同年业发展出双色标记技术； 1995年，Schielen et.al.: 首次将PVDF膜板引入ELISPOT 1997年，Gui et.al.：发展出计算机辅助的斑点技术技术。 1.ELISPOT技术起源与发展 T细胞在免疫系统中起着关键性的作用，尤其是起免疫调节作用的辅助细胞Th。它们参与了细胞免疫(Th1)和体液免疫(Th2) 抗原或者有丝分裂原刺激T细胞、单核/巨噬细胞分泌细胞因子 Th1 cells ? IFN-γ,IL-2 Th2 cells ? IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 Tc cells ? IFN-γ, TNF-β, 颗粒酶B，穿孔素 单核/巨噬细胞 ? TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-10, IL-12 细胞因子的分泌以及对效应细胞的调节构成了一个精确的免疫系统调节网络。 2.细胞与细胞因子 用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以斑点显色的方式将其表现出来。 3.ELISPOT技术原理 4.ELISPOT 和 ELISA的区别 　ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破传统 ELISA 法，是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展。两者都可检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同: ELISA测定的是蛋白浓度，ELISPOT测定的是细胞频率；（整体水平与单细胞水平） ELISA是免疫检测Immuno-Assay，而ELISPOT是生物检测Bio-Assay（活细胞，功能检测） ELISA检测的特异性表现在抗体上，ELISPOT检测的特异性及表现在双重的刺激源和抗体上。 5.ELISPOT的优点 目前，检测细胞因子或者细胞免疫反应的方法有以下几种：ELISA、ELISPOT、FACS、Tetramer、3H胸苷参入法、51Cr释放法。 高灵敏：度少至100－1,000个分子/Cell即能够被检测。比ELISA的灵敏度高200倍。 单细胞水平：即使只有一个阳性细胞也能够检测出来，比FACS灵敏。 高通量：每个研究人员每天可作数百样本的检测。High Throughput Screening 在106抗原呈递细胞（APC）中混入已知数量的IFN-γ阳性T淋巴细胞，然后用三种方法分别进行检测。 X坐标：各检测方法的检测结果 Y坐标：每百万APC中实际IFN-γ+T细胞数量 ELISPOT/FACS/ELISA 检测精确度比较 ELISPOT 流式荧光染色 ELISA 第二部分：技术特点 技术操作流程 ELISPOT技术要点 塑料板与膜板 膜结构与抗体包被 细胞处理 有血清与无血清 刺激物选择 建立阳性对照 调整适当的细胞浓度 预培养法与直接法 各种染色系统 包被抗体 4℃ 过夜，洗涤； 封闭37 ℃ 1h； 加入淋巴细胞和刺激原37 ℃孵育8-40h； 冰水裂解并移出细胞，洗涤； 加入生物素标记的检测抗体37 ℃ 1h，洗涤； 加入酶联亲和素37 ℃ 1h，