酶与细胞的固定化技术 (2).ppt

(1)将适宜的酶与抗原或抗体结合在一起。制成酶标抗体（或酶标抗原 ）； (2)将酶标抗体（或酶标抗原）与样品中的待测抗原（或抗体）混合，通过免疫反应二者即可特异性地结合在一起，形成酶－抗体－抗原复合物。通过酶催化反应的速度即可测定复合物中酶的含量，进而测出样品中的待测抗原（或抗体）的量。 酶联免疫测定 第六十三页，共63页。 固定化酶性质 固定化对酶稳定性影响：1）对热稳定性提高；2）对变性剂、抑制剂的耐受性提高；3）对蛋白酶抵抗能力增加、储存稳定性和操作稳定性有所增强。 最适温度：一般与游离酶相似。 最适pH：受载体带电性和产物性质等最适pH会受一定影响。 底物特异性：是否变化与底物的分子质量大小有一定关系。 米氏常数：固定化酶的表观米氏常数随载体带电性能而变化。 第三十一页，共63页。 固定化酶操作的注意事项 活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。 功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合 酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。 第三十二页，共63页。 分类方式 固定化细胞 分类方式 固定化细胞 细胞类型 微生物 植物 动物 生理状态 死细胞:完整细胞,细胞碎片, 细胞器 活细胞:增殖细胞,静止细胞, 饥饿细胞 细胞的固定化方法 第三十三页，共63页。 1) 直接固定法 不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。 一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。 2)吸附法 3)包埋法 2. 固定化方法 第三十四页，共63页。 与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。 固定化细胞的特点 第三十五页，共63页。 固定化酶（细胞）的评价指标（一） 固定化酶（细胞）活力：固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。 通常采用间歇测定和连续测定方法。 蛋白总量：1）双辛可宁酸法(BCA法) ；2）考马斯亮蓝法 。 半衰期：在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示，是衡量稳定性的一项重要指标。 第三十六页，共63页。 如果耦联率与酶活力回收率相近，则表明固定化方法对酶活力没有明显影响。 固定化酶（细胞）的评价指标（二） 偶联率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力×100% 活力回收率=固定化酶总活力/加入酶的总活力×100% 相对活力=固定化酶总活力/ (加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)×100% 第三十七页，共63页。 乙酰 -DL — Ala L — Ala +乙酸 乙酰 -D — Ala 固定化酶与固定化细胞的应用 一、在工业生产上的应用 1. 氨基酰化酶（Aminoacylase） 世界上第一种工业化生产的固定化酶 第三十八页，共63页。 泵 储 罐 反应产物 离心机 消旋反应器 固定化酶柱子 晶体 L-Ala L-Ala A-D-Ala A-L-Ala A-D-Ala 第三十九页，共63页。 2.葡萄糖异构酶 世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。 第四十页，共63页。 二、固定化酶在医学上的应用 1. 消血栓： 纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。 酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。 用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。 第四十一页，共63页。 2. 人工肾： 原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。 第四十二页，共63页。 酶传感器 固定化酶和电化学传感器的结合。 优点： ①既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度； ②酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。 三、在分析检测中的应用 第四十三页，共63页。 Sensitive and specific Rapid Simple Biosensor 第四十四页，共63页。 1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧