细胞生物学研究方法.pptxVIP

第三章细胞生物学研究方法;;;;1. 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。;3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 R=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率 ＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 思考：如何提高显微镜的分辨能力？;表一、几种介质的折射率;显微镜的几个光学特点： 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。 sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。;（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope;Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green;（三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM;laser confocal scanning microscope, LCSM;（四）暗视野显微镜 dark field microscope;把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。;原理;用途：观察未经染色的玻片标本;（六）偏光显微镜polarizing microscope;（七）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）;（八）倒置显微镜 inverse microscope ;（九）当代显微镜的发展趋势;二、电子显微镜;以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。;透射电子显微镜;表二、不同光线的波长;2、制样技术;2）负染技???;3）冰冻蚀刻 freeze-etching;20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。;Scanning electron microscope（ SEM）;工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。;扫描电子显微镜原理;人类红细胞;酵母;人类精子;（三）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM;扫描隧道显微镜原理;STM image, Benzene molecules accumulate at step edges on Cu;三、显微操作技术micromanipulation technique;显微操作仪;第二节 生物化学与分子生物学技术;组织化学和细胞化学染色方法（histochemical and cytochemical staining method）用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。 （一）固定 物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。;（二）显示方法;二、免疫细胞化学 immunocytochemistry;三、显微光谱分析技术;四、放射自显影术;五、分子杂交技术;（二）Southern杂交;六、PCR 技术;PCR原理;第三节 细胞分离技术;一、离心技术;（一）差速离心 Differential c