PCR反应程序[借鉴].pdf

PCR 反应程序 1．常规程序 将 PCR 反应所需的成分配置完后， 在 PCR 仪上于 94-96℃ 预加 热几十秒至几分钟，使模板 DNA 充分变性，然后进入扩增循环。 在每一个循环中， 先于 94℃ 保持 30 秒钟使模板变性， 然后将温度 降到复性温度（一般 50-60℃ 之间），一般保持 30 秒钟，使引物 与模板充分退火；在 72℃ 保持 1 分钟（扩增 1kb 片段），使引物 在模板上延伸，合成 DNA ，完成一个循环。重复这样的循环 25～ 35 次，使扩增的 DNA 片段大量累积。最后，在 72℃ 保持 3-7min ， 使产物延伸完整， 4 ℃ 保存。 2．复性（退火）和延伸温度 复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60℃ 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定。延伸温度绝大多数设 定为 72℃ 。如果复性的温度很高， 可以将延伸温度和复性温度设置 成同一温度，变成二步法 PCR 。 3．反应时间 变性步骤一般使用 30 秒钟， 如果模板的 G+C 含量较高， 或直接 用细胞做模板， 变性时间可适当延长。 复性时间有 30 秒种一般是足 够的。延伸时间由扩增产物的大小决定， 一般采用 1kb 用 1 分钟来 保证充足的时间。 4．循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为 104～105 数量级时，循环数通常为 25～35 次。 平台效应 （plateau effect）：PCR 扩增过程后期会出现的产物的积 累按减弱的指数速率增长的现象。 原因：底物和引物的浓度已经降低， dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低， 产生的焦磷酸会出现末 端产物抑制作用， 非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作 用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。 5．PCR 反应液的配制 PCR 反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。 常规方法 与其它酶学反应一样， 在最后加入 DNA 聚合酶。早期的 PCR 仪没 有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。 对于使用具 3’-5’外切活性的高温 DNA 聚合酶时，有时会扩增 不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制， A 管含 模板、引物和 dNTP ，以及调整体积的 H2O ， B 管含缓冲液、 DNA 聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个 问题。 按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。 热启动（ hot start）PCR 操作方式可较好解决这一问题。将 dNTP 、 缓冲液， Mg2+ 和 primer 先配制好，然后加入一粒蜡珠（如 Ampli Wax PCR Qam100），加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加 入模板和 DNA